Nieuws

Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com.De browserversie die u gebruikt, heeft beperkte CSS-ondersteuning.Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen).Om voortdurende ondersteuning te garanderen, zullen we de site in de tussentijd weergeven zonder stijlen en JavaScript.
Kankercellen hebben verschillende mechanismen ontwikkeld om cellulaire stress te overwinnen en verder te gaan.Eiwitkinase R (PKR) en zijn eiwitactivator (PACT) zijn de eerste responders die verschillende stresssignalen volgen die leiden tot remming van celproliferatie en apoptose.De regulatie van de PACT-PKR-route in kankercellen blijft echter grotendeels onbekend.Hier vonden we dat lang niet-coderend RNA (lncRNA) aspartyl-tRNA-synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) direct betrokken is bij de remming van de PACT-PKR-route en de proliferatie van kankercellen bevordert.Met behulp van grootschalige functionele screening van CRISPRi 971 kankergeassocieerd lncRNA, ontdekten we dat DARS-AS1 geassocieerd was met significant verbeterde proliferatie van kankercellen.Daarom remt DARS-AS1 knock-out celproliferatie en bevordert het de apoptose van kankercellen in verschillende kankercellijnen in vitro en vermindert het de tumorgroei in vivo significant.Mechanisch bindt DARS-AS1 direct aan het PACT-activeringsdomein en voorkomt PACT-PKR-interactie, waardoor PKR-activering, eIF2α-fosforylering en remming van apoptotische celdood worden verminderd.Klinisch wordt DARS-AS1 op grote schaal tot expressie gebracht in meerdere kankers, en overexpressie van dit lncRNA is indicatief voor een slechte prognose.Deze studie verheldert kankerspecifieke regulatie van de PACT-PKR-route door DARS-AS1 lncRNA en biedt een ander doelwit voor de prognose en behandeling van kanker.
Het vermogen om zich aan te passen aan stress is een belangrijk kenmerk van de overleving en proliferatie van kankercellen.De snelle proliferatie en metabole kenmerken van kanker pieken in barre micro-omgevingen - ontbering van voedingsstoffen, hypoxie en lage pH - die signaalroutes voor celdood kunnen veroorzaken.Ontregeling van stressgevoelige genen zoals p535, heat shock-eiwitten 6, 7, KRAS8, 9 en HIF-110, 11, 12, 13 wordt vaak waargenomen bij kanker, waardoor apoptose wordt geblokkeerd en overleving wordt bevorderd.
Eiwitkinase R (PKR) is een belangrijke stresssensor en subeenheidkinase van eukaryote initiatiefactor 2α (eIF2α), een translationele regulator die cellulaire stress koppelt aan celdood.PKR werd oorspronkelijk geïdentificeerd als een antiviraal eiwit door de detectie van een vreemd dubbelstrengs RNA (dsRNA).Na activering fosforyleert PKR eIF2α om de virale en cellulaire eiwitsynthese te remmen14,15,16.PACT (PKR activator eiwit) is geïdentificeerd als het eerste PKR activator eiwit in de afwezigheid van dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Door directe interactie met PKR, transduceert PACT verschillende spanningen (serumuithongering, peroxide- of arsenietbehandeling) naar PKR en stroomafwaartse signaalroutes.Naast eIF2α-fosforylering triggert PACT-gemedieerde PKR-activering verschillende gebeurtenissen die verband houden met de stressrespons, waaronder veranderde redoxstatus via de PI3K/Akt24-route, verbeterde controle van DNA-schade via p5325,26 en NF-κB27,28 Reguleert transcriptie, 29. Gezien hun cruciale rol bij stressrespons, proliferatie, apoptose en andere belangrijke cellulaire processen, zijn PKR en PACT veelbelovende therapeutische doelen voor veel ziekten, met name kanker30,31,32,33.Ondanks deze pleiotrope functionele en biologische betekenis blijft de regulatie van PACT/PKR-activiteit in kankercellen echter ongrijpbaar.
lncRNA's zijn transcripten groter dan 200 nucleotiden zonder eiwitcoderend vermogen.Sinds geavanceerde projecten voor het sequeneren van het hele genoom duizenden lncRNA's hebben geïdentificeerd, is er veel moeite gedaan om hun biologische functies op te helderen.Een groeiend aantal onderzoeken heeft aangetoond dat lncRNA's betrokken zijn bij veel biologische processen37, waaronder de regulatie van X-chromosoominactivatie38,39, imprinting40, transcriptie41,42, translatie43 en zelfs kankergroei44,45,46,47.Deze studies meldden dat veel lncRNA's betrokken zijn bij de PACT/PKR-route.Een dergelijke studie toonde aan dat lncRNA ASPACT de PACT-transcriptie remde en de nucleaire retentie van PACT-mRNA verhoogde.Andere studies hebben aangetoond dat lncRNA nc886 bindt aan PKR en de fosforylering ervan remt49,50.Tot dusverre is lncRNA dat PACT-gemedieerde PKR-activering reguleert niet gerapporteerd.
Aspartyl-tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) is geïdentificeerd als een oncogeen lncRNA51,52,53,54.Door de regulatie van miP-194-5p53, miP-12952 en miP-532-3p51 is aangetoond dat DARS-AS1 de groei van respectievelijk heldercellig niercelcarcinoom, schildkliercarcinoom en niet-kleincellig longcarcinoom bevordert.Tong en collega's ontdekten ook dat DARS-AS1 de progressie van myeloom bevordert door de stabiliteit van het eiwit 39 (RBM39) RNA-bindende motief te behouden.Er zijn echter geen onderzoeken uitgevoerd naar de vraag of dit lncRNA betrokken is bij de regulatie van PACT-PKR-activering en de stressrespons van kankercellen.
Hier hebben we een grootschalig functieverliesscherm uitgevoerd met behulp van het CRISPRi-systeem en vastgesteld dat DARS-AS1 lncRNA de proliferatie van verschillende soorten kankercellen bevordert.Daarnaast hebben we een belangrijk mechanisme geïdentificeerd: DARS-AS1 bindt direct aan PACT, remt PACT- en PKR-binding, voorkomt fosforylering van eIF2α, een lager PKR-substraat, en remt uiteindelijk apoptotische celdood.Concluderend onthult ons werk het DARS-AS1 lncRNA als een regulator van de PACT-PKR-route en een potentieel doelwit voor de behandeling en prognose van kanker.
Uitgebreide genomische profileringsstudies hebben honderden lncRNA's geïdentificeerd die geassocieerd zijn met kanker.Hun functie blijft echter grotendeels onbekend56.Om veelbelovende lncRNA-kandidaten die betrokken zijn bij kankerprogressie te identificeren, voerden we een functieverliesscherm uit voor verminderde proliferatie in de SW620 colorectale kankercellijn met behulp van het CRISPRi-systeem (Fig. 1a).Het unieke kenmerk van de SW480- en SW620-cellijnen voor colonkanker is dat ze zijn afgeleid van primaire en secundaire tumoren bij één patiënt.Dit biedt een waardevolle vergelijking voor het bestuderen van genetische veranderingen in de progressie van gevorderde darmkanker.Daarom analyseerden we de transcriptomen van colorectale kankercellijnen (SW480 en SW620) met behulp van RNA-sequencing en verzamelden we enkele potentiële functionele lncRNA's uit de gepubliceerde literatuur.Op basis van deze resultaten hebben we een gepoolde sgRNA-bibliotheek ontworpen die 7355 sgRNA-oligo's bevat die zich richten op 971 kankergeassocieerde lncRNA's en 500 ongerichte sgRNA-oligo's voor een negatieve controle (aanvullende gegevens 1).
Schematische weergave van screening met behulp van het CRISPRi-systeem.b sgRNA-verrijking na screening.De horizontale stippellijn staat voor log2 (fold change) = ±0,58.De verticale stippellijn geeft de p-waarde = 0,05 aan.Zwarte stippen vertegenwoordigen niet-doelwit sgRNA (aangeduid als NC).Rode stippen zijn sgRNA's gericht op DARS-AS1.Blauwe stippen zijn sgRNA's gericht op LINC00205, een eerder beschreven oncogeen lncRNA.fold change = (genormaliseerde uitlezing, dag 17)/(genormaliseerde uitlezing, dag 0).c DARS-AS1-sgRNA-knockdown remde de celgroei.Foutbalken vertegenwoordigen ± standaarddeviatie van de drie experimenten.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 tweezijdige Student's t-test.d DARS-AS1-expressie in tumoren (TCGA-dataset).em Expressie van DARS-AS1 in gepaarde normale en tumormonsters van patiënten met respectievelijk BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP en COAD (TCGA-dataset).p-waarden werden verkregen met behulp van gepaarde tweezijdige Student's t-test.
Na het construeren van het plasmide en het verpakken van het lentivirus, hebben we de dCas9-SW620 colorectale kankercellijn getransduceerd met de bovenstaande bibliotheek in vier onafhankelijke infectie-experimenten.De multipliciteit van infectie (MOI) voor deze infecties was 0,1-0,3, wat aangeeft dat elke cel slechts met één sgRNA kan worden getransfecteerd.Na 18 dagen in vitro-kweek nam het verrijkingsprofiel van doel-sgRNA's af of toe na screening, terwijl het aantal niet-gerichte controle-oligonucleotiden relatief onveranderd bleef in vergelijking met het pre-screeningprofiel, wat aangeeft dat ons doelwit een zeer schermspecifieke bibliotheek.Rijst.1b en aanvullende tabel 1). LINC00205, waarvan eerder werd gemeld dat het de progressie van longkanker en leverkanker bevordert58,59,60, werd gescreend (log2 (foldchange) <-0,58, p-waarde <0,05), wat de betrouwbaarheid van deze screening bevestigt (Fig. 1b). LINC00205, waarvan eerder werd gemeld dat het de progressie van longkanker en leverkanker bevordert58,59,60, werd gescreend (log2 (foldchange) <-0,58, p-waarde <0,05), wat de betrouwbaarheid van deze screening bevestigt (Fig. 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1b). LINC00205, waarvan eerder werd gemeld dat het de progressie van longkanker en leverkanker bevordert 58,59,60, werd uitgesloten (log2 (voudige verandering) <-0,58, p-waarde <0,05), wat de robuustheid van deze screening bevestigt (Fig. .1b) . LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0.58，p 值<0.05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0.58，p 值<0.05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1b). LINC00205, waarvan eerder werd gemeld dat het de progressie van long- en leverkanker bevordert 58,59,60, werd uitgesloten (log2 (voudige verandering) <-0,58, p-waarde <0,05), wat de robuustheid van deze screening bevestigt (Fig. .1b).
Van alle geteste lncRNA's werd DARS-AS1 ook gescreend, waarbij de drie verwante sgRNA-oligonucleotiden significant waren verminderd na 18 dagen kweken, wat suggereert dat knockdown van dit lncRNA resulteerde in verminderde kankerproliferatie (figuur 1b).Dit resultaat werd verder ondersteund door MTS-analyse in colorectale kankercellen die aantoonden dat de groeisnelheid van DARS-AS1-knockdown-cellen slechts gehalveerd was in vergelijking met controlecellen (Figuur 1c) en consistent was met eerdere rapporten van verschillende andere kankertypes.: heldercellige nierkanker, schildklierkanker en niet-kleincellige longkanker51,52,53,55.De functie en moleculaire mechanismen ervan bij colorectale kanker blijven echter onontgonnen.Daarom kozen we dit lncRNA voor verder onderzoek.
Om DARS-AS1-expressie bij patiënten te bestuderen, hebben we 10.327 tumormonsters van het Cancer Genome Atlas (TCGA) -project uitgebreid geanalyseerd.Onze resultaten laten zien dat DARS-AS1 op grote schaal tot expressie wordt gebracht en significant wordt opgereguleerd in gezonde cellen in een verscheidenheid aan tumoren, waaronder colonadenocarcinoom (COAD), renaal heldercelcarcinoom (KIRC) en renaal papillair celcarcinoom (KIRP)..Zeer weinig (Fig. 1d en Aanvullende Fig. 1a, b). Analyse van gepaarde gezonde/tumormonsters bevestigde verder een significant hogere expressie van DARS-AS1 in de tumoren van blaas urotheelcarcinoom (BLCA), nier nier clear cell carcinoom (KIRC), prostaat adenocarcinoom (PRAD), long plaveiselcelcarcinoom (LUSC) , baarmoeder corpus endometriumcarcinoom (UCEC), longadenocarcinoom (LUAD), lever hepatocellulair carcinoom (LIHC), nier nier papillair celcarcinoom (KIRP) en colon adenocarcinoom (COAD) (p-waarde <0,05) (Fig. 1e-m) . Analyse van gepaarde gezonde/tumormonsters bevestigde verder een significant hogere expressie van DARS-AS1 in de tumoren van blaas urotheelcarcinoom (BLCA), nier nier clear cell carcinoom (KIRC), prostaat adenocarcinoom (PRAD), long plaveiselcelcarcinoom (LUSC) , baarmoeder corpus endometriumcarcinoom (UCEC), longadenocarcinoom (LUAD), lever hepatocellulair carcinoom (LIHC), nier nier papillair celcarcinoom (KIRP) en colon adenocarcinoom (COAD) (p-waarde <0,05) (Fig. 1e-m) .Analyse van gepaarde gezonde/tumormonsters bevestigde ook een significant hogere expressie van DARS-AS1 in urotheelcarcinoom van de blaas (BLCA), clear cell nier- en niercelcarcinoom (KIRC), prostaatadenocarcinoom (PRD), long plaveiselcelcarcinoom (LUSC) tumoren., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m) . , endometriumcarcinoom van het corpus uteri (UCEC), adenocarcinoom van de long (LUAD), hepatocellulair carcinoom van de lever (LIHC), papillair celcarcinoom van de nier (KIRP) en adenocarcinoom van het colon (COAD) (p-waarde < 0,05) (Fig. 1e–m) .配对健康/肿瘤样本的分析进一步证实了DARS-AS1 在膀胱尿路上皮癌(BLCA)、肾肾透明细胞癌(KIRC)、前列腺腺癌(PRD)、肺鳞状细胞癌(LUSC) 肿瘤中的显着更高表达，子宫体子宫内膜癌（UCEC），肺腺癌（LUAD），肝肝细胞癌（LIHC），肾肾乳头状细胞癌（KIRP）和结肠腺癌（COAD）（p值<0.05）（图1e-m） .配对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 dars-os1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 (prad) 、 细胞癌 细胞癌(lusc) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中显着 更 高 表达 ， 内膜 癌 （（ucel） 肺腺癌 （luad） 肝肝 细胞癌 （lihc） 肾 肾 乳头状 细胞癌 （kirp） （coad） （p 值<0.05）（图1e-m） .Analyse van gezonde/tumor-gepaarde monsters ondersteunde verder de rol van DARS-AS1 in urotheelcarcinoom van de blaas (BLCA), clear cell niercelcarcinoom (KIRC), prostaatadenocarcinoom (PRD) en long plaveiselcelcarcinoom (LUSC) tumoren.экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). expressie in corpus baarmoedercarcinoom (UCEC), longadenocarcinoom (LUAD), hepatocellulair carcinoom (LIHC), renaal papillair celcarcinoom (KIRP) en colonadenocarcinoom (COAD) (p-waarde <0.05) (Figuur 1e-m).Alles bij elkaar geven deze resultaten aan dat DARS-AS1 op grote schaal en in hoge mate tot expressie wordt gebracht in een verscheidenheid aan kankers.
Omdat DARS-AS1 en DARS (het gen dat codeert voor de antisense-streng) dezelfde promotor delen en zich naast elkaar bevinden, hebben we shRNA ontworpen om specifiek DARS-AS1 uit te schakelen, maar niet DARS (aanvullende figuur 2a, b en aanvullende tabel 2) .Naast SW620 hebben we ook drie andere cellijnen gebruikt die DARS-AS1 in hoge mate tot expressie brengen om de werkzaamheid en functie van shRNA-knockdown te bestuderen (aanvullende tabel 3).Onze resultaten gaven aan dat alle drie de ontwikkelde shRNA's ten minste 80% DARS-AS1 knockdown-efficiëntie bereikten met weinig effect op de hoeveelheid DARS-mRNA (aanvullende figuur 2c-f).Bovendien vonden we dat DARS-AS1 knockdown met deze shRNA's de celgroei significant remde in colorectale kankercellijnen SW620 (49,7%) en HCT116 (27,7%), borstkankercellijn MBA-MD-231 (53,4%).) en de HepG2-hepatoomcellijn (92,7% reductie), evenals hun vermogen om niet-verankerde bollen te vormen (gemiddelde reductie van ~ 50,8%, 44,6%, 40,7% en 75,7% per cellijn) (Fig. 2a, b).In SW620 bevestigden de resultaten van de kolonievormingstest verder dat DARS-AS1-shRNA de celproliferatie significant remde met een gemiddelde afname van ongeveer 69,6% (figuur 2c).
Effect van controle-shRNA en DARS-AS1-shRNA op celproliferatie (a) en sferoïdevorming (b) in SW620-, HCT116-, MBA-MD-231- en HepG2-cellen.c Effect van controle-shRNA en DARS-AS1-shRNA op kolonievorming in SW620-cellen.Celproliferatie (d), sferoïdevorming (e) en kolonievorming (f) van SW620-cellen die DARS-AS1 tot overexpressie brengen.Getoonde gegevens zijn het gemiddelde ± standaarddeviatie van drie experimenten.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 en *** p ≤ 0,001 door tweezijdige Student's t-test.
Als aanvulling op onderzoek naar functieverlies hebben we vervolgens SW620-cellen gemaakt die DARS-AS1 tot overexpressie brengen (aanvullende figuur 2g).Overexpressie van DARS-AS1 verhoogde significant de celgroei (1,8-voudig), niet-verankerde sferoïdevorming (1,4-voudig) en kolonievorming (3,3-voudig) in SW620-cellen (Fig. 2d-f).We hebben dit resultaat bevestigd met behulp van een andere cellijn die DARS-AS1 tot expressie brengt, A549.Deze verbeterde celproliferatie als gevolg van overexpressie van DARS-AS1 werd verder waargenomen in A549-cellen (aanvullende figuur 2h, i en aanvullende tabel 3).Alles bij elkaar genomen tonen deze winst- en verliesstudies aan dat DARS-AS1 de proliferatie van kankercellen in vitro bevordert.
Om het onderliggende mechanisme te onderzoeken waarmee DARS-AS1 celproliferatie reguleert, hebben we een RNA pull-down-analyse uitgevoerd om de potentiële eiwitbindende partners te identificeren.RT-qPCR-resultaten toonden aan dat ongeveer 86,2% van DARS-AS1 zich in het cytoplasma van SW620-cellen bevindt (aanvullende figuur 3a).Het in vitro getranscribeerde gebiotinyleerde DARS-AS1 of pseudoRNA werd vervolgens geïncubeerd met SW620-cellysaten gevolgd door SDS-PAGE-scheiding.Daaropvolgende zilverkleuring toonde aan dat een afzonderlijke band (~ 38 kDa) significant was verrijkt in DARS-AS1-trekmonsters, maar niet in dummy-RNA- of kralenmonsters (figuur 3a).Deze band werd geïdentificeerd als een PKR-activerend eiwit (PACT) door massaspectrometrie (MS) en verder bevestigd door immunoblotting in SW620-, HCT116- en HepG2-cellijnen (Fig. 3a, b).De verrijking van DARS en verwante PACT-eiwitten - PKR en TRBP - werd ook onderzocht met behulp van RNA-analyse door Western blotting (WB).De resultaten gaven aan dat er geen directe interactie tussen DARS-AS1-RNA en deze drie eiwitten werd gevonden (aanvullende figuur 3b).De specifieke interactie tussen DARS-AS1 en PACT werd verder bevestigd door RNA-immunoprecipitatie (RIP) -analyse, waaruit bleek dat DARS-AS1 significant was verrijkt met anti-PACT-antilichamen maar niet met andere controle-RNA's (Figuur 3c).Om te bepalen of DARS-AS1 direct interageert met PACT bij afwezigheid van andere cellulaire componenten, werd een in vitro biolaag-interferometrie (BLI)-assay uitgevoerd met behulp van gezuiverd PACT.Biotine-gelabeld DARS-AS1 of dummy RNA werd geïmmobiliseerd op streptavidine (SA) biosensoren en vervolgens geïncubeerd in kinetische buffer met 1 M PACT.PACT bond met name sterk aan DARS-AS1 (KD-waarde ~ 26,9 nM), maar niet om RNA na te bootsen (Figuur 3d).Alles bij elkaar genomen tonen deze resultaten een directe interactie en hoge affiniteit aan tussen DARS-AS1 en PACT.
RNA-trekanalyse identificeerde DARS-AS1 interactie met PACT in SW620-cellen.Hierboven zilverkleuring van verwante eiwitten.Lagere immunoblots werden uitgevoerd met anti-PACT-antilichaam.b RNA pull-down-analyse werd uitgevoerd in HCT116 (boven) en HepG2 (onder) cellen.PACT-verrijking werd gedetecteerd door immunoblotting.cRNA-immunoprecipitatie (RIP) -assays werden uitgevoerd in SW620-cellen met behulp van de aangegeven antilichamen.d PACT-bindingscurven voor DARS-AS1 of controle-RNA van volledige lengte werden verkregen met behulp van biolaaginterferometrie (BLI).RNA werd geïmmobiliseerd op een streptavidine-biosensor.1 M PACT werd gebruikt om de associatie te meten.De RNA-trektest werd uitgevoerd met behulp van gebiotinyleerde DARS-AS1 van volledige lengte of ingekort (boven).Immunoblot met ontvangen PACT (onder).f Gezuiverd gevlagd PACT werd geïncubeerd met gebiotinyleerd DARS-AS1 van volledige lengte of ingekort (zoals in e) voor in vitro RIP-assay.Het geëxtraheerde RNA werd geverifieerd door RT-qPCR.g De relatieve affiniteit van verschillende RNA-fragmenten voor PACT werd verkregen met behulp van biolaag-interferometrie.Voor analyse werden 100 nM RNA en 1 μM RAST gebruikt.h In vitro RIP-assays werden uitgevoerd met behulp van gezuiverde intacte of ingekorte gelabelde PACT.Het geëxtraheerde RNA werd geverifieerd door RT-qPCR.i Groeisnelheid van SW620-cellen die DARS-AS1, PACT of beide tot overexpressie brengen.j Overexpressie van volledige of afgeknotte DARS-AS1 in SW620-cellen had verschillende effecten op de celgroei.k Apoptose werd gedetecteerd door immunoblotting met anti-PARP-antilichaam.l Knock-out van DARS-AS1 induceert apoptose van SW620-cellen, zoals blijkt uit flowcytometrie.Getoonde gegevens zijn het gemiddelde ± standaarddeviatie van drie experimenten. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, door tweezijdige Student's t-test. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, door tweezijdige Student's t-test. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 о двустороннему критерию ента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 door tweezijdige Student's t-test. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 о двустороннему критерию ента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 door tweezijdige Student's t-test.
Vervolgens hebben we drie gebiotinyleerde DARS-AS1-RNA-fragmenten gegenereerd door in vitro transcriptie om de DARS-AS1-regio te identificeren die nodig is voor PACT-associatie (Figuur 3e).De RNA-analyseresultaten toonden aan dat elk fragment in staat was om een ​​interactie aan te gaan met PACT, maar het 3'-terminale gebied (384-768 nucleotiden gelabeld A3) vertoonde meer dan 1-384 nucleotiden gelabeld A1) (Fig. 3e).Vergelijkbare resultaten werden waargenomen in de in vitro RIP-test met behulp van recombinant PACT (Figuur 3f).In overeenstemming met deze resultaten toonden experimenten om geïmmobiliseerde RNA-fragmenten aan PACT te binden met behulp van BLI ook aan dat PACT een hogere affiniteit heeft voor A3 (384-768 nt) (KD-waarde van ongeveer 94,6 nM), terwijl er bijna geen verbindingen zijn met andere gebieden.(Fig. 3d).
We hebben ook de bijbehorende bindingsgebieden in PACT onderzocht.PACT bevat drie functionele domeinen, waarvan twee geconserveerde dubbelstrengs RNA-bindende domeinen (dsRBD) en een derde domein (aangeduid als D3) dat fungeert als een activator van eiwitinteracties.Om de lncRNA-bindingscapaciteit van elk domein te onderzoeken, hebben we drie mutaties ontwikkeld die elk van de drie domeinen verwijderden en een in vitro RIP-assay uitgevoerd.Onze resultaten toonden aan dat deletie van het derde domein (D3) van PACT de interactie met DARS-AS1 significant verminderde (met 0,11-voudig vergeleken met intact PACT) in vergelijking met de andere twee mutaties (Fig. 3h), er werd aangetoond dat de afgifte van D3 interageerde met DARS.-AC1.Alles bij elkaar genomen suggereren deze resultaten dat interactie tussen DARS-AS1 en PACT voornamelijk kan plaatsvinden via het 3'-uiteinde van DARS-AS1 en het D3-domein van PACT.
We merkten op dat DARS-AS1 geen effect had op PACT-expressie en PACT had geen effect op DARS-AS1 (aanvullende figuur 3c).Vervolgens onderzochten we het effect van PACT-knockdown op celgroei.In tegenstelling tot DARS-AS1 groeiden relatieve cellen 1, 5-3 keer sneller toen PACT werd neergehaald (aanvullende figuur 3d).De resultaten van de kolonievormingstest gaven aan dat de cellen 2-3-voudige kolonies vormden na shRNA-behandeling met PACT (aanvullende figuur 3e).Om te testen of DARS-AS1 celproliferatie reguleert via PACT, hebben we SW620-cellen gegenereerd die PACT, DARS-AS1 of beide tot overexpressie brengen.Overexpressie van PACT vertoonde een significante remming van celproliferatie (Figuur 3i).Hoewel overexpressie van DARS-AS1 op zich de celproliferatie significant bevorderde, was er geen significant verschil in de groeisnelheid van cellen die DARS-AS1 en PACT tot overexpressie brachten.Deze resultaten suggereren dat PACT de verhoogde proliferatie veroorzaakt door DARS-AS1-overexpressie kan tegengaan.
Omdat verschillende regio's van DARS-AS1 verschillende PACT-bindende vermogens hebben, hebben we hun relatieve invloed op celproliferatie onderzocht door verschillende overexpressie van DARS-AS1-fragmenten.Vergeleken met de andere twee fragmenten, werd DARS-AS1 tot overexpressie gebracht aan het 3'-uiteinde (384-768 nt), het belangrijkste PACT-gerelateerde gebied in DARS-AS1, dat het hoogste vermogen had om celproliferatie te stimuleren (Fig. 3j).Deze resultaten duiden op een positieve correlatie tussen het bindingsvermogen en de biologische functie van DARS-AS1.
Van PACT is gemeld dat het een pro-apoptotisch eiwit is .Daarom hebben we het effect van DARS-AS1 op apoptose onderzocht.Zoals verwacht, verhoogde DARS-AS1-knockdown de PARP-splitsing in SW620-cellen aanzienlijk en verhoogde het aandeel annexine V-positieve cellen in SW620-, HCT116-, HepG2- en MBA-MD-231-cellijnen (figuur 3k).3).3f-h), wat aangeeft dat het anti-apoptotische effect van DARS-AS1 in kankercellen tegengesteld is aan de apoptose-inducerende functie van PACT.Alles bij elkaar genomen suggereren deze resultaten dat het mechanisme van de oncogene functie van DARS-AS1 kan zijn door remming van de PACT-functie.
Vervolgens hebben we de functionele implicaties van de DARS-AS1-PACT-associatie onderzocht.Van PACT is gemeld dat het PKR activeert via directe interactie, wat vervolgens de eIF2α-fosforylering verbetert, wat leidt tot translationele deletie en apoptose .Eerst hebben we onderzocht of DARS-AS1 de cellulaire lokalisatie van PACT en PKR beïnvloedt.Confocale fluorescentiemicroscopie toonde aan dat PACT en PKR sterk gecolokaliseerd waren in SW620-cellen met een gemiddelde Pearson-correlatiecoëfficiënt van 0,72.Ondertussen verminderde DARS-AS1-overexpressie de PACT- en PKR-co-lokalisatie aanzienlijk (gemiddelde Pearson-correlatiecoëfficiënt 0, 61) (Figuur 4a).Om te onderzoeken of DARS-AS1 de PACT-PKR-interactie kon moduleren, voerden we een co-immunoprecipitatie (co-IP) test uit met anti-PACT-antilichaam in SW620-cellysaten.PKR was sterk verrijkt aan anti-PACT in controlecellen, terwijl PKR-herstel significant was verminderd in lysaten van cellen die DARS-AS1 tot overexpressie brengen (figuur 4b).Gezuiverd gemerkt PACT en PKR werden gebruikt voor in vitro eiwitbindingstesten.Dienovereenkomstig vertoonden degenen die DARS-AS1 maar geen controle-RNA leverden onderdrukte PACT-PKR-interactie (Figuur 4c).Alle resultaten toonden aan dat DARS-AS1 de PACT- en PKR-communicatie verstoorde.
een co-lokalisatie van PACT en PKR in controlecellen of cellen die DARS-AS1 tot overexpressie brengen, werd waargenomen met behulp van confocale fluorescentiemicroscopie.De kernen werden gekleurd met DAPI.Statistische resultaten werden verkregen van 16 foto's.b Co-immunoprecipitatie (co-IP) met behulp van anti-PACT-antilichaam in cellysaten van SW620-controlecellen of cellen die DARS-AS1 tot overexpressie brengen.c Gelabeld PACT, gezuiverd PKR en in vitro getranscribeerd met DARS-AS1 of schijn-RNA werden geïncubeerd voor in vitro eiwitbindingsanalyse.Anti-vlag-antilichamen werden gebruikt voor immunoprecipitatie.d Immunoblots met de aangegeven antilichamen werden uitgevoerd in SW620- en HCT116-cellen die waren getransfecteerd met controle-shRNA of DARS-AS1-shRNA, gevolgd door serumverhongering.De DARS-AS1-expressieniveaus veranderden de cellulaire gevoeligheid voor thapsigargin.SW620-cellen werden getransfecteerd met DARS-AS1-shRNA, DARS-AS1-overexpressieplasmide of controleplasmide.Cellen werden gedurende 48 uur met thapsigargin behandeld en de levensvatbaarheid van de cellen werd bepaald met behulp van het MTS-reagens.f In vitro getranscribeerd DARS-AS1 of dummy RNA en gezuiverd PACT werden gebruikt voor in vitro activeringsassays en immunoblotdetectie.g Immunoblots met deze antilichamen werden uitgevoerd op SW620-ctrl-cellen (links) of cellen die PKR-mutanten tot overexpressie brengen (rechts).Deze cellen werden vervolgens getransfecteerd met controle-shRNA of DARS-AS1-shRNA gevolgd door serumverhongering.h Flowcytometrie toonde aan dat inactivatie van de mutante PKR compenseerde voor DARS-AS1-geïnduceerde apoptose in SW620-cellen.i Immunoblots met de aangegeven antilichamen werden uitgevoerd in SW620 (links) of HCT116 (rechts) cellen.Cellen die zijn getransfecteerd met controle-shRNA of DARS-AS1-shRNA zijn serumarm en aangevuld met 100 nM PKR C16-remmer of DMSO.Schaalbalk = 5 µm.Getoonde gegevens zijn het gemiddelde ± standaarddeviatie van drie experimenten.* p ≤ 0,05 tweezijdige Student's t-toets.
Algemeen wordt aangenomen dat zodra PACT een interactie aangaat met PKR17, PKR-fosforylering op Thr451 kan worden geïnduceerd.Onze resultaten gaven aan dat het niveau van PKR-fosforylering significant verhoogd was in DARS-AS1-knockdown-cellen na serumverhongering (figuur 4d en aanvullende figuur 4a).Dienovereenkomstig vonden we dat fosforylering van eIF2α, het belangrijkste PKR-substraat, ook significant werd verhoogd door DARS-AS1-shRNA (figuur 4d en aanvullende figuur 4a).Thapsigargin is een ER-stressor die ervoor zorgt dat het ER Ca2+ afgeeft.Van behandeling met thapsigargin is gemeld dat het de expressie en activering van PACT induceert, dat verder interageert met PKR en dit activeert, wat leidt tot apoptose door verhoging van de eIF2α-fosforylering 18,61.Hier gebruikten we thapsigargin als stimulator van de PACT/PKR-route om te onderzoeken of DARS-AS1 cellen kan helpen stress te overwinnen door de PACT/PKR-route te remmen.We zagen dat het niveau van DARS-AS1-expressie positief correleerde met celresistentie tegen thapsigargin.SW620-cellen die DARS-AS1 tot overexpressie brengen, overleefden beter wanneer ze werden behandeld met thapsigargin, terwijl cellen met DARS-AS1-knockdown vatbaarder werden (Fig. 4e).In overeenstemming met deze resultaten verminderde DARS-AS1-overexpressie de door thapsigargin geïnduceerde PKR-fosforylering (aanvullende figuur 4b).Daarentegen werden na behandeling met thapsigargin PKR en eIF2α in hogere mate gefosforyleerd in DARS-AS1 knockdown-cellen in vergelijking met controlecellen (aanvullende figuur 4b).Interessant is dat thapsigargin DARS-AS1-expressie op een dosisafhankelijke manier induceerde, wat kan wijzen op een antistressfunctie van DARS-AS1 (aanvullende figuur 4c).Daarnaast hebben we in vitro activatie-assays uitgevoerd om deze waarnemingen te bevestigen.In het kort, PKR werd gezuiverd uit cellysaten met behulp van een anti-PKR-antilichaam, vervolgens geïncubeerd met recombinant PACT en DARS-AS1 in vitro getranscribeerd.Na de enzymatische reactie werd fosfo-PKR gedetecteerd met behulp van WB.Onze resultaten gaven aan dat PKR-fosforylering significant werd geremd door DARS-AS1, maar niet door controle-RNA (Figuur 4f).Deze in vitro en in vivo resultaten suggereren dat DARS-AS1 PACT-gemedieerde PKR-activering remt.Tegelijkertijd zagen we ook een afname van PACT-herstel in aanwezigheid van DARS-AS1 (Figuur 4f).Dit resultaat is consistent met de resultaten van de in vitro eiwitbindingstest (Figuur 4c) en illustreert opnieuw de blokkerende functie van DARS-AS1 voor PACT-PKR-associatie.
Ser246 en Ser287 in het D3-domein van PACT zijn vereist voor PKR-activering onder cellulaire stress.Vervanging van twee serineresiduen door alanine gaf mutant PACT (mutD), die PKR activeerde in afwezigheid van stress, en vervanging door alanine (mutA) keerde het protocol om.Omdat we het belang van dit domein in directe associatie met DARS-AS1 hebben aangetoond, hebben we deze twee PACT-mutanten gegenereerd om te testen of deze residuen ook betrokken zouden kunnen zijn bij interactie met DARS-AS1.Interessant genoeg verloren beide mutanten het vermogen om te binden aan DARS-AS1 (aanvullende figuur 4d), wat suggereert dat de volledige structuur van het PACT-eiwit nodig kan zijn voor een efficiënte interactie met DARS-AS1.
Bovendien suggereren onze resultaten ook dat door DARS-AS1-shRNA geïnduceerde remming van celproliferatie gedeeltelijk kan worden hersteld door een dominante negatieve PACT-mutant (PACTmutA) of een dominante negatieve PKR-mutant (PKRmut) tot overexpressie te brengen (aanvullende figuur 4e. e).Overexpressie van dominant-negatieve PKR-mutanten verminderde PKR-fosforylering geïnduceerd door DARS-AS1-knockdown evenals eIF2a-fosforylering in serum-beroofde cellen (Fig. 4g).Wat nog belangrijker is, was dat het aandeel apoptotische cellen geïnduceerd door DARS-AS1 knockdown ook verminderd was in cellen die PKRmut tot overexpressie brengen (Fig. 4h en Aanvullende Fig. 4g).Remming van PKR-kinase-activiteit schaadt ook de DARS-AS1-functie, aangezien de resultaten aantoonden dat DARS-AS1-knockdown zelden PKR- en eIF2α-fosforylering veroorzaakte wanneer cellen werden behandeld met een PKR-specifieke C16-remmer (Fig. 4i en Aanvullende Fig. 4h).).Alles bij elkaar genomen suggereren onze resultaten dat DARS-AS1 celproliferatie bevordert, althans gedeeltelijk, door PACT-gemedieerde PKR-activering te remmen.
Om de rol van DARS-AS1 bij tumorigenese verder te onderzoeken, hebben we in vivo experimenten uitgevoerd met behulp van een muis-xenotransplantaatmodel. Resultaten tonen aan dat knockdown van DARS-AS1 de tumorgroei bij muizen dramatisch verminderde (p-waarde <0,0001) (Fig. 5a). Resultaten tonen aan dat knockdown van DARS-AS1 de tumorgroei bij muizen dramatisch verminderde (p-waarde <0,0001) (Fig. 5a). езультаты оказывают, о нокдаун DARS-AS1 езко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (рис. 5а). De resultaten laten zien dat DARS-AS1 knockdown de tumorgroei bij muizen drastisch vermindert (p-waarde <0,0001) (Figuur 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0,0001）（图5a）。结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a）。 езультаты показали, о нокдаун DARS-AS1 ачительно снижает рост опухоли у мышей (значение р <0,0001) (рис. 5а). De resultaten toonden aan dat DARS-AS1 knockdown de tumorgroei bij muizen significant verminderde (p-waarde <0,0001) (Figuur 5a).Dus in de DARS-AS1 knockdown-groep was er een significante afname van het gemiddelde tumorvolume met ongeveer 72,9% en de gemiddelde tumormassa met ongeveer 87,8% (Figuur 5b-d).Deze resultaten suggereren sterk dat DARS-AS1 tumorgroei in vivo significant kan bevorderen.
Effecten van advertentie DARS-AS1 knockdown op colorectale oncogenese bij naakte muizen.Groeicurven (a), tumorgrootte (b), gewicht (c) en tumorbeelden (d) worden getoond.Foutbalken vertegenwoordigen ± SEM. n = 10. ****p < 0,0001, door tweezijdige Student's t-test. n = 10. ****p < 0,0001, door tweezijdige Student's t-test. n = 10. ****p < 0,0001 о двустороннему итерию ента. n = 10. ****p < 0,0001 tweezijdige Student's t-toets.n = 10. ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0,0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 о двустороннему итерию ента. ****p < 0,0001 tweezijdige Student's t-test.e Kaplan-Meier analyseerde de correlatie tussen DARS-AS1-expressieniveaus en algehele overleving bij patiënten met UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM en LGG.Hoge niveaus van DARS-AS1-expressie bij patiënten waren in de top 50%;het lage niveau van DARS-AS1-expressie bij patiënten was in de onderste 50%.p-waarden werden bepaald met behulp van de log rank-test.f Voorgesteld model waarin DARS-AS1 de PACT-PKR-route en tumorgroei reguleert.
Om de klinische impact van DARS-AS1 beter te begrijpen, hebben we de correlatie tussen de expressie ervan en de overleving van de patiënt onderzocht.Door de TCGA-dataset te analyseren, ontdekten we dat hogere DARS-AS1-expressie geassocieerd was met uveal melanoom (UVM), renale chromofobie (KICH), renaal papillair celcarcinoom (KIRP), mesothelioom (MESO), multiplex.Lagere overleving was significant geassocieerd met glioblastoommorfose (GBM) en patiënten met laaggradig hersenglioom (LGG) (Figuur 5e).Deze resultaten suggereren dat DARS-AS1 een belangrijke rol kan spelen bij klinische tumorprogressie en mogelijk een voorspellende biomarker kan zijn bij meerdere kankers.
In deze studie, met behulp van grootschalige CRISPRi-functionele screening, hebben we vastgesteld dat DARS-AS1 lncRNA kankercelstress overwint door twee belangrijke stress-responders, PACT en PKR, te reguleren.Door directe interactie met PACT, remde DARS-AS1 PACT-gemedieerde PKR-activering, waardoor apoptotische celdood werd voorkomen en celproliferatie werd bevorderd (Fig. 5f).Opregulatie van DARS-AS1 is waargenomen bij meerdere soorten kanker, wat suggereert dat de functie van het bevorderen van de overleving van kankercellen onder stressvolle omstandigheden breed toepasbaar kan zijn op meerdere soorten kanker.
PACT is geïdentificeerd als een PKR-activatoreiwit en PACT-gemedieerde PKR-activering speelt een belangrijke rol bij stressreacties door transcriptie, translatie, apoptose en andere belangrijke cellulaire processen te reguleren62.Decennialang zijn er pogingen gedaan om de kankerspecifieke regulatie van de PACT-PKR-cascade te begrijpen.Hier onthulde onze studie een ander regulatiemechanisme van PACT-PKR in kankercellen via cellulair lncRNA DARS-AS1, dat direct bindt aan PACT, PACT-PKR-interactie blokkeert, PKR-activering en eIF2α-fosforylering remt, waardoor door stress geïnduceerde apoptose wordt geremd en het stimuleren van de uiteindelijke proliferatie van kanker.cellen.Deze ontdekking werpt licht op mogelijke lncRNA-doelen voor de prognose en therapie van kanker.
Onze gegevens toonden aan dat DARS-AS1 knockdown cellen sensibiliseert voor serumhonger met een significante toename van gefosforyleerd PKR en eIF2α.Deze resultaten suggereren dat DARS-AS1 de overleving van kankercellen onder zware omstandigheden bevordert door de PACT/PKR-activiteit te remmen.Verschillende andere niet-coderende RNA's, zoals ASPACT en nc886, zijn ook betrokken bij de PACT/PKR-as door het downreguleren van PACT48-mRNA of het reguleren van autofosforylering door binding aan PKR49,50,64.Onder hen fungeert DARS-AS1 als een disruptor van de PACT-PKR-associatie.Deze studie verrijkt ons begrip van PACT / PKR-asregulatie en de rol van lncRNA's bij stressreacties.
PACT bevat drie afzonderlijke domeinen.Elk van de eerste twee dsRBD's is voldoende om binding met hoge affiniteit van PACT aan PKR te bereiken, terwijl het derde domein (D3) vereist is voor PKR-activering in vitro en in vivo.Onze studie toonde aan dat DARS-AS1 bij voorkeur interageert met het D3-domein (figuur 3h).Gezien de grote omvang van het lncRNA (768 nucleotiden), kan DARS-AS1-binding aan D3 de interactie tussen het PACT-domein van dsRBD en PKR fysiek remmen, waardoor de associatie van PACT en PKR wordt geblokkeerd.PACT-puntmutaties die Ser246 en Ser287 in D3 vervingen door alanine of aspartaat verstoorden de bindingsaffiniteit voor DARS-AS1, wat wijst op het belang van de algemene structurele en elektrische eigenschappen van D3 in hun associatie.Verdere details van dit mechanisme zullen in de toekomst nodig zijn, met behulp van nauwkeurigere biochemische analyse en PACT-structuuranalyse met hoge resolutie.
Eerdere studies hebben gemeld dat DARS-AS1 celproliferatie bevordert via verschillende mechanismen51,52,53.In één voorbeeld merkten onderzoekers op dat DARS-AS1 zijn antisense-eiwit-coderende DARS-gen opreguleerde door miP-194-5p in nierkankercellen te targeten.In de huidige studie had DARS-AS1 knockdown echter weinig effect op DARS-transcriptie bij meerdere soorten kanker, waaronder ten minste colorectale, borst- en leverkanker.Omdat lncRNA's cel- en weefselspecifieke expressiepatronen vertonen, zijn functionele mechanismen mogelijk niet geconserveerd tussen kankertypes, wat kan bijdragen aan deze discrepantie tussen onze waarnemingen en eerdere beoordelingen van verschillende kankers.Speciale studies zijn nodig om de specifieke mechanismen van verschillende fysiologische en pathologische processen op te helderen.
Een analyse van klinische gegevens toonde aan dat DARS-AS1-expressie in tumoren omgekeerd gecorreleerd is met de overleving van kankerpatiënten, wat het belang van de DARS-AS1/PACT/PKR-as in de prognose van kanker onderstreept.Concluderend, onze studie toont aan dat DARS-AS1 een regulator is van de PACT/PKR-signaleringsas, de proliferatie van kankercellen bevordert en apoptose remt tijdens de stressrespons, wat een andere onderzoekslijn biedt en van belang is voor toekomstig onderzoek naar mogelijke behandelingen .
Menselijke cellijnen SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 en HEK293T werden verkregen van de National Cell Line Resource Infrastructure in China.Alle cellen werden gehouden in DMEM-medium (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) aangevuld met 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) en 1% penicilline-streptomycine (Thermo Fisher Scientific) bij 37 ° C, 5% CO2.broedmachine.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (fosfo-T451), Abcam (ab81303);Anti-vlag, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));anti-eIF2a (fosfor S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (fosfor S246), Abgent (AP7744b);anti-β-tubuline, CST (2128);normale muis IgG, CST (5415S);normaal konijn IgG, CST (2729S).Antilichamen werden 1:1000 verdund in PBST voor Western-blotting en 1:100 voor IP.
sgRNA's werden ontwikkeld met behulp van een openbaar beschikbare tool genaamd CRISPR-ERA66.We gebruikten de standaard gereedschapsparameters voor sgRNA-ontwikkeling en het algoritme berekende sgRNA-bindingsplaatsen in de 3 kb-regio.gecentreerd op TSS.Pools van sgRNA-oligonucleotiden werden gesynthetiseerd bij CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) en gekloneerd in gehumaniseerde pgRNA-plasmiden (Addgene #44248).Een totaal van 12 µg gepoold gehumaniseerd pgRNA-plasmide, 7,2 µg psPAX2 (Addgene #12260) en 4,8 µg pMD2.G (Addgene #12259) werden gecotransfecteerd in 5 x 106 HEK293T in schalen van 10 cm met behulp van DNAfect Transfection Reagent cellen (CWBIO, Beijing, China) volgens de instructies van de fabrikant.Virusbevattende supernatanten werden 48 en 72 uur na transfectie verzameld en gefiltreerd door een filter van 0,45 µm.Voor screening werden SW620-cellen die het dCas9/KRAB-fusie-eiwit tot expressie brengen, verkregen door virustransductie.Gemodificeerde SW620-cellen werden geïnfecteerd met de virusbibliotheek in vier onafhankelijke infectie-experimenten bij een MOI van 0,1-0,3 en werden bemonsterd met 2 g/ml puromycine (Sigma, St. Louis, MO) gedurende 2 dagen.Daarna werden cellen gedurende 18 dagen in vitro gekweekt met een minimale bibliotheekdekking van 500 cellen/sgRNA voor screening.
Genomisch DNA werd geëxtraheerd volgens de instructies van de QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Duitsland; 51183).In totaal werd 100 g genomisch DNA per biologische herhaling gebruikt om de bibliotheek te bouwen.Het sgRNA-gebied werd geamplificeerd door twee PCR-rondes en gekoppeld aan een streepjescode.
PCR-producten werden gezuiverd met behulp van NucleoSpin®-gel en PCR-zuiveringskit (MACHEREY-NAGEL, Düren, Duitsland; 740609.250) en gekwantificeerd met behulp van Qubit™ HS dubbelstrengs DNA-detectiekit (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
De MTS-assay werd gebruikt om celproliferatie te meten.Cellen werden gezaaid in platen met 96 putjes met een initiële dichtheid van 2000 cellen/putje.Het relatieve aantal cellen werd dagelijks gemeten op het aangegeven tijdstip gedurende een totaal van 4-6 dagen.Voor elk putje werd 20 l MTS-reagens (Promega) verdund met 100 l DMEM, 4 uur bij 37 ° C met cellen geïncubeerd en vervolgens werd OD490 gemeten.
Het vermogen tot onverankerde groei werd ontdekt door de vorming van bollen te analyseren.In het kort werden 2000 cellen getransfecteerd met shRNA DARS-AS1 of controle-shRNA gekweekt in microplaten met ultralage hechting (Corning) met elke 4 dagen een mediumverversing.De sferoïden werden na 14 dagen geteld.500 cellen getransfecteerd met het DARS-AS1-overexpressieplasmide of een controleplasmide werden gebruikt voor de versterkingstest, anders was de methode ongewijzigd.
RNA werd getranscribeerd met behulp van T7 RNA-polymerase en biotine-16-UTP (Roche 1138908910) volgens de instructies van Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).De hier gebruikte primers staan ​​vermeld in aanvullende tabel 4.
Eiwitcoderende PACT- of PKR-regio's werden gekloneerd in pET15b (Addgene #73619) en getransformeerd in BL21(DE3).De bacteriën werden overnacht geïncubeerd in LB voorzien van ampicilline en vervolgens 100-voudig verdund met vers LB.Toen de OD600 van het medium 0,8 bereikte, werd 1 mM IPTG toegevoegd om eiwitexpressie te induceren.Na een nacht incubatie onder zacht schudden (250 rpm bij 20°C) werd de celpellet verzameld door middel van centrifugatie (4000 rpm, 10 min, 4°C).Resuspendeer de celpellet in lysisbuffer (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) en incubeer op ijs gedurende 30 minuten, vervolgens ultrasone trillingen ten (15 min, 5 s aan/uit, op ijs) en centrifugeer (13.000 toerental)., 30 min, 4°С).Het supernatant werd vervolgens 3 keer bij 4°C op Ni-NTA-hars (QIAGEN) geladen, 4 keer gewassen met wasbuffer (50 mM Tris, pH 8,0, 40 mM imidazool, 250 mM NaCl) en 3 keer geëlueerd, met een totaal van 10 ml eluensbuffer (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazool).Gezuiverd eiwit werd bepaald met behulp van WB en de concentratie werd bepaald met behulp van de Qubit™ eiwittestkit (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
RIP-assays werden uitgevoerd zoals eerder beschreven, met modificaties.In het kort, 1x RIP-buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5% NP-40, RNasin-ribonucleaseremmer (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, protease) lyseert cytostatische 1 x 107 cocktail (Roche, 1 mM DTT) en centrifugeer bij 13.000 rpm gedurende 15 minuten bij 4 ° C.Het supernatant werd vervolgens geïncubeerd met proteïne A+G magnetische kralen (Millipore) geconjugeerd met 5 g anti-PACT-antilichaam (Abeam) of IgG (CST).De kralen werden 5 keer gewassen met 5x RIP-buffer en vervolgens gedigereerd met proteïnase K (NEB).RNA werd geëxtraheerd met Trizol en bepaald met RT-qPCR.Primers worden weergegeven in aanvullende tabel 5.
De in vitro RIP-assay werd uitgevoerd volgens een aangepast standaard RIP-assayprotocol.Een totaal van 5 pmol in vitro getranscribeerd RNA werd 1x verdund met RIP-buffer en geanneald door incubatie bij 65°C gedurende 5 minuten gevolgd door langzaam afkoelen tot kamertemperatuur.Een totaal van 5 pmol intacte of gemuteerde vlaggelabelde PACT-eiwitten werd gezuiverd uit E. coli.Incubeer met gerenatureerd RNA gedurende 2 uur bij 4°C en volg de bovenstaande procedure voor RIP-analyse voor anti-vlag IP.
Voor RNA-verlengingsanalyse werden 1 x 107 cellen gelyseerd met 1xRIP-buffer.Na 15 minuten centrifugeren bij 13.000 rpm bij 4 ° C, werd het supernatant gedurende 2 uur bij 4 ° C voorbehandeld met 30 μl magnetische streptavidine-parels (Beckman).Het gezuiverde lysaat werd vervolgens voorzien van gist-tRNA en een nacht bij 4°C geïncubeerd met 40 pmol gerenatureerd RNA, daarna nog 2 uur en 20 l nieuwe magnetische streptavidine-parels geblokkeerd met BSA werd toegevoegd.De wasstap bestond uit 4 keer met 5x RIP-buffer en 4 keer met 1x RIP-buffer.De overeenkomstige eiwitten werden geëlueerd met biotine-elutiebuffer (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 12,5 mM D-biotine, PMSF) en gescheiden op NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).Na zilverkleuring (Beyotime Biotechnology) werden bepaalde banden uitgesneden en geanalyseerd door MS.
Co-IP-analyse werd uitgevoerd om de interactie tussen PACT en PKR te testen.In het kort werden supernatantlysaten bereid door 1 x 107 gelyseerde cellen in 1 x RIP-buffer te incuberen, gevolgd door 15 minuten centrifugeren bij 13.000 rpm bij 4°C.Lysaten werden beladen met magnetische proteïne A + G-korrels, geconjugeerd met 5 ug anti-PACT-antilichaam en gedurende de nacht zachtjes geroteerd bij 4°C.De kralen werden 3 keer gewassen met 5 x RIP-buffer, tweemaal met 1 x RIP-buffer en geëlueerd met 1 x SDS-buffer.Het teruggewonnen eiwit werd geanalyseerd met SDS-PAGE-gel en gedetecteerd met WB.
Twee pmol gevlagd PACT en 1 pmol PKR werden gezuiverd uit E. coli.Verdun in 1 x RIP-buffer en incubeer met 10 pmol gerenatureerd RNA gedurende 2 uur bij 4 °C.Daarna werden ze nog eens twee uur geïncubeerd met aan proteïne A+G met magnetische korrels geconjugeerd anti-gelabeld antilichaam.De kralen werden vervolgens vier keer gewassen met 1x RIP-buffer en geëlueerd met 1x SDS-buffer.De resulterende PACT en PKR werden gedetecteerd door WB.