Nieuws

Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com.De browserversie die u gebruikt, heeft beperkte CSS-ondersteuning.Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen).Om voortdurende ondersteuning te garanderen, zullen we de site in de tussentijd weergeven zonder stijlen en JavaScript.
Effectieve fotosensitizers zijn vooral belangrijk voor het wijdverbreide klinische gebruik van fototherapie.Conventionele fotosensitizers hebben echter over het algemeen last van absorptie op korte golflengte, onvoldoende fotostabiliteit, lage kwantumopbrengst van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en door aggregatie geïnduceerde uitdoving van ROS.Hier rapporteren we een bijna-infrarood (NIR) supramoleculaire fotosensitizer (RuDA) gemedieerd door zelfassemblage van Ru (II) -areen organometaalcomplexen in waterige oplossing.RuDA kan alleen singlet-zuurstof (1O2) genereren in geaggregeerde toestand, en het vertoont duidelijk aggregatie-geïnduceerd 1O2-generatiegedrag als gevolg van een significante toename van het crossover-proces tussen het singlet-triplet-systeem.Onder invloed van 808 nm laserlicht vertoont RuDA een 1O2-kwantumopbrengst van 16,4% (FDA-goedgekeurd indocyaninegroen: ΦΔ=0,2%) en een hoge fotothermische conversie-efficiëntie van 24,2% (commerciële gouden nanostaafjes) met uitstekende fotostabiliteit.: 21,0%, gouden nanoschelpen: 13,0%).Bovendien kunnen RuDA-NP's met goede biocompatibiliteit bij voorkeur accumuleren op tumorplaatsen, wat een significante tumorregressie veroorzaakt tijdens fotodynamische therapie met een vermindering van 95,2% in tumorvolume in vivo.Deze aggregatiebevorderende fotodynamische therapie biedt een strategie voor het ontwikkelen van fotosensitizers met gunstige fotofysische en fotochemische eigenschappen.
Vergeleken met conventionele therapie is fotodynamische therapie (PDT) een aantrekkelijke behandeling voor kanker vanwege de significante voordelen, zoals nauwkeurige spatiotemporele controle, niet-invasiviteit, verwaarloosbare resistentie tegen geneesmiddelen en minimalisering van bijwerkingen 1,2,3.Onder lichte bestraling kunnen de gebruikte fotosensitizers worden geactiveerd om zeer reactieve zuurstofsoorten (ROS) te vormen, wat leidt tot apoptose/necrose of immuunresponsen4,5. De meeste conventionele fotosensibilisatoren, zoals chloor, porfyrine en antrachinonen, hebben echter een relatief korte golflengte-absorptie (frequentie < 680 nm), wat resulteert in een slechte lichtpenetratie vanwege de intense absorptie van biologische moleculen (bijv. hemoglobine en melanine) in het zichtbare gebied6,7. De meeste conventionele fotosensibilisatoren, zoals chloor, porfyrine en antrachinonen, hebben echter een relatief korte golflengte-absorptie (frequentie < 680 nm), wat resulteert in een slechte lichtpenetratie vanwege de intense absorptie van biologische moleculen (bijv. hemoglobine en melanine) in het zichtbare gebied6,7. Однако большинство обычных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, обладают относительно коротковолновым поглощением (частота < 680 нм), что приводит к плохому проникновению света из-за интенсивного поглощения биологических молекул (например, гемоглобина и меланина) в видимая область6,7. De meest voorkomende fotosensibilisatoren zoals chloor, porfyrines en antrachinonen hebben echter een relatief korte golflengteabsorptie (< 680 nm), wat resulteert in een slechte lichtpenetratie als gevolg van intense absorptie van biologische moleculen (bijv. hemoglobine en melanine) in het zichtbare gebied6,7.然而，大多数传统的光敏剂，如二氢卟酚、卟啉和蒽醌，具有相对较短的波长吸收（频率< 680 nm），因此由于对生物分子（如血红蛋白和黑色素）的强烈吸收， ik然而 ， 大多数 传统 的 光敏剂 ， 二 氢 卟酚 、 卟啉 蒽醌 ， 具有 相对 较 短 的 波长 吸收 （频率 频率 <680 nm） 因此 由于 对 分子 （血红 蛋白 和 黑色素） 的 ， ， ， ， 吸收 吸收吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 HI导致光穿透性差。 Однако большинство традиционных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, имеют относительно коротковолновое поглощение (частота < 680 нм) из-за сильного поглощения биомолекул, таких как гемоглобин и меланин, что приводит к плохому проникновению света. De meeste traditionele fotosensitizers zoals chloor, porfyrinen en antrachinonen hebben echter een relatief korte golflengteabsorptie (frequentie < 680 nm) vanwege de sterke absorptie van biomoleculen zoals hemoglobine en melanine, wat resulteert in een slechte lichtpenetratie.Zichtbaar gebied 6.7.Daarom zijn bijna-infrarood (NIR) absorberende fotosensitizers die worden geactiveerd in het 700-900 nm "therapeutische venster" zeer geschikt voor fototherapie.Omdat nabij-infrarood licht het minst wordt geabsorbeerd door biologische weefsels, kan het leiden tot diepere penetratie en minder fotoschade8,9.
Helaas hebben bestaande NIR-absorberende fotosensitizers over het algemeen een slechte fotostabiliteit, een laag singletzuurstof (1O2)-genererend vermogen en aggregatie-geïnduceerde 1O2-quenching, wat hun klinische toepassing beperkt10,11.Hoewel er grote inspanningen zijn geleverd om de fotofysische en fotochemische eigenschappen van conventionele fotosensitizers te verbeteren, hebben tot dusverre verschillende rapporten gemeld dat NIR-absorberende fotosensitizers al deze problemen kunnen oplossen.Bovendien hebben verschillende fotosensitizers veelbelovend getoond voor een efficiënte generatie van 1O212,13,14 wanneer ze worden bestraald met licht boven 800 nm, aangezien de fotonenergie snel afneemt in het nabije-IR-gebied.Trifenylamine (TFA) als elektronendonor en [1,2,5]thiadiazool-[3,4-i]dipyrido[a,c]fenazine (TDP) als elektronenacceptorgroep Donor-acceptor (DA) type kleurstoffen een klasse van kleurstoffen, die bijna-infrarood absorberen, die uitgebreid zijn bestudeerd voor nabij-infrarood bio-imaging II en fotothermische therapie (PTT) vanwege hun smalle bandgap.Zo kunnen kleurstoffen van het DA-type worden gebruikt voor PDT met bijna-IR-excitatie, hoewel ze zelden zijn bestudeerd als fotosensitizers voor PDT.
Het is algemeen bekend dat de hoge efficiëntie van intersystem crossing (ISC) van fotosensitizers de vorming van 1O2 bevordert.Een algemene strategie om het ISC-proces te bevorderen, is om de spin-orbit-koppeling (SOC) van fotosensitizers te verbeteren door zware atomen of speciale organische delen te introduceren.Deze benadering heeft echter nog enkele nadelen en beperkingen19,20.Onlangs heeft supramoleculaire zelfassemblage gezorgd voor een intelligente bottom-up benadering voor de fabricage van functionele materialen op moleculair niveau, met tal van voordelen in fototherapie: (1) zelf-geassembleerde fotosensitizers kunnen het potentieel hebben om lintstructuren te vormen.Vergelijkbaar met elektronische structuren met een dichtere verdeling van energieniveaus vanwege overlappende banen tussen bouwstenen.Daarom zal de energieovereenkomst tussen de lagere aangeslagen singlet-toestand (S1) en de aangrenzende triplet-aangeslagen toestand (Tn) worden verbeterd, wat gunstig is voor het ISC-proces 23, 24 .(2) Supramoleculaire assemblage zal niet-stralingsrelaxatie verminderen op basis van het intramoleculaire bewegingsbeperkingsmechanisme (RIM), dat ook het ISC-proces bevordert 25, 26 .(3) Het supramoleculaire samenstel kan de binnenste moleculen van het monomeer beschermen tegen oxidatie en degradatie, waardoor de fotostabiliteit van de fotosensitizer aanzienlijk wordt verbeterd.Gezien de bovenstaande voordelen zijn wij van mening dat supramoleculaire fotosensitizersystemen een veelbelovend alternatief kunnen zijn om de tekortkomingen van PDT te verhelpen.
Op Ru(II) gebaseerde complexen zijn een veelbelovend medisch platform voor mogelijke toepassingen bij de diagnose en therapie van ziekten vanwege hun unieke en aantrekkelijke biologische eigenschappen28,29,30,31,32,33,34.Bovendien bieden de overvloed aan aangeslagen toestanden en de afstembare fotofysicochemische eigenschappen van op Ru (II) gebaseerde complexen grote voordelen voor de ontwikkeling van op Ru (II) gebaseerde fotosensitizers35,36,37,38,39,40.Een opmerkelijk voorbeeld is het ruthenium(II)polypyridylcomplex TLD-1433, dat zich momenteel in klinische fase II-onderzoeken bevindt als fotosensibilisator voor de behandeling van niet-spierinvasieve blaaskanker (NMIBC)41.Bovendien worden organometaalcomplexen van ruthenium(II)areen veel gebruikt als chemotherapeutische middelen voor de behandeling van kanker vanwege hun lage toxiciteit en gemakkelijke modificatie42,43,44,45.De ionische eigenschappen van Ru (II) -areen organometaalcomplexen kunnen niet alleen de slechte oplosbaarheid van DA-chromoforen in gewone oplosmiddelen verbeteren, maar ook de assemblage van DA-chromoforen verbeteren.Bovendien kan de pseudo-octaëdrische half-sandwichstructuur van de organometaalcomplexen van Ru(II)-arenen sterisch H-aggregatie van DA-type chromoforen voorkomen, waardoor de vorming van J-aggregatie met roodverschoven absorptiebanden wordt vergemakkelijkt.De inherente nadelen van Ru(II)-areencomplexen, zoals lage stabiliteit en/of slechte biologische beschikbaarheid, kunnen echter de therapeutische werkzaamheid en in vivo activiteit van areen-Ru(II)-complexen beïnvloeden.Studies hebben echter aangetoond dat deze nadelen kunnen worden overwonnen door rutheniumcomplexen in te kapselen met biocompatibele polymeren door fysieke inkapseling of covalente conjugatie.
In dit werk rapporteren we DA-geconjugeerde complexen van Ru (II) -areen (RuDA) met een NIR-trigger via een coördinatiebinding tussen de DAD-chromofoor en de Ru (II) -areengroep.De resulterende complexen kunnen zichzelf assembleren tot metalosupramoleculaire blaasjes in water als gevolg van niet-covalente interacties.Met name de supramoleculaire assemblage begiftigde RuDA met door polymerisatie geïnduceerde intersysteem-cross-over-eigenschappen, die de ISC-efficiëntie aanzienlijk verhoogden, wat zeer gunstig was voor PDT (figuur 1A).Om tumoraccumulatie en in vivo biocompatibiliteit te vergroten, werd door de FDA goedgekeurde Pluronic F127 (PEO-PPO-PEO) gebruikt om RuDA47,48,49 in te kapselen om RuDA-NP-nanodeeltjes te creëren (Figuur 1B) die fungeerden als een zeer efficiënte PDT/Dual- modus PTT-proxy.Bij kankerfototherapie (Figuur 1C) werd RuDA-NP gebruikt om naakte muizen met MDA-MB-231-tumoren te behandelen om de werkzaamheid van PDT en PTT in vivo te bestuderen.
Schematische illustratie van het fotofysische mechanisme van RuDA in monomere en geaggregeerde vormen voor kankerfototherapie, synthese van B RuDA-NP's en C RuDA-NP's voor NIR-geactiveerde PDT en PTT.
RuDA, bestaande uit TPA- en TDP-functionaliteit, werd bereid volgens de procedure die wordt weergegeven in aanvullende figuur 1 (figuur 2A), en RuDA werd gekenmerkt door 1H- en 13C NMR-spectra, elektrospray-ionisatiemassaspectrometrie en elementanalyse (aanvullende figuren 2-4 ).De RuDA-elektronendichtheidsverschilkaart van de laagste singlet-overgang werd berekend door tijdsafhankelijke dichtheidsfunctionaaltheorie (TD-DFT) om het ladingsoverdrachtsproces te bestuderen.Zoals weergegeven in aanvullende figuur 5, drijft de elektronendichtheid voornamelijk van trifenylamine naar de TDP-acceptoreenheid na foto-excitatie, wat kan worden toegeschreven aan een typische intramoleculaire ladingsoverdracht (CT) -overgang.
Chemische structuur van erts B Absorptiespectra van erts in mengsels van verschillende verhoudingen van DMF en water.C Genormaliseerde absorptiewaarden van RuDA (800 nm) en ICG (779 nm) versus tijd bij 0,5 W cm-2 van 808 nm laserlicht.D De fotodegradatie van ABDA wordt aangegeven door RuDA-geïnduceerde vorming van 1O2 in DMF/H2O-mengsels met verschillende watergehalten onder invloed van laserstraling met een golflengte van 808 nm en een vermogen van 0,5 W/cm2.
Samenvatting—UV-zichtbare absorptiespectroscopie werd gebruikt om de zelfassemblage-eigenschappen van erts in mengsels van DMF en water in verschillende verhoudingen te bestuderen.Zoals getoond in afb.2B vertoont RuDA absorptiebanden van 600 tot 900 nm in DMF met een maximale absorptieband bij 729 nm.Het verhogen van de hoeveelheid water leidde tot een geleidelijke roodverschuiving van het ertsabsorptiemaximum tot 800 nm, wat wijst op J-aggregatie van erts in het geassembleerde systeem.De fotoluminescentiespectra van RuDA in verschillende oplosmiddelen worden getoond in aanvullende figuur 6. RuDA lijkt typische NIR-II-luminescentie te vertonen met een maximale emissiegolflengte van ca.1050 nm in respectievelijk CH2Cl2 en CH3OH.De grote Stokes-verschuiving (ongeveer 300 nm) van RuDA duidt op een significante verandering in de geometrie van de aangeslagen toestand en de vorming van aangeslagen toestanden met lage energie.De luminescentie-kwantumopbrengsten van erts in CH2Cl2 en CH3OH werden bepaald op respectievelijk 3,3 en 0,6%.In een mengsel van methanol en water (5/95, v/v) werd echter een lichte roodverschuiving van de emissie en een afname van de kwantumopbrengst (0,22%) waargenomen, wat mogelijk te wijten is aan de zelfassemblage van erts .
Om de zelfassemblage van ORE te visualiseren, hebben we vloeibare atoomkrachtmicroscopie (AFM) gebruikt om de morfologische veranderingen in ORE in methanoloplossing na toevoeging van water te visualiseren.Wanneer het watergehalte lager was dan 80%, werd geen duidelijke aggregatie waargenomen (aanvullende figuur 7).Echter, met een verdere toename van het watergehalte tot 90-95%, verschenen er kleine nanodeeltjes, die de zelfassemblage van erts aangaven.Bovendien had laserbestraling met een golflengte van 808 nm geen invloed op de absorptie-intensiteit van RuDA in waterige oplossing (Fig. 2C en Aanvullende Fig. 8).Daarentegen daalde de absorptie van indocyaninegroen (ICG als controle) snel bij 779 nm, wat wijst op een uitstekende fotostabiliteit van RuDA.Bovendien werd de stabiliteit van RuDA-NP's in PBS (pH = 5,4, 7,4 en 9,0), 10% FBS en DMEM (hoge glucose) onderzocht met UV-zichtbare absorptiespectroscopie op verschillende tijdstippen.Zoals weergegeven in aanvullende figuur 9, werden kleine veranderingen in RuDA-NP-absorptiebanden waargenomen in PBS bij pH 7,4/9.0, FBS en DMEM, wat wijst op uitstekende stabiliteit van RuDA-NP.In een zuur milieu (рН = 5,4) werd echter hydrolyse van erts gevonden.We hebben ook de stabiliteit van RuDA en RuDA-NP verder geëvalueerd met behulp van hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) -methoden.Zoals weergegeven in aanvullende figuur 10, was RuDA het eerste uur stabiel in een mengsel van methanol en water (50/50, v/v) en werd na 4 uur hydrolyse waargenomen.Er werd echter alleen een brede concave-convexe piek waargenomen voor RuDA NP's.Daarom werd gelpermeatiechromatografie (GPC) gebruikt om de stabiliteit van RuDA NP's in PBS (pH = 7,4) te beoordelen.Zoals weergegeven in aanvullende figuur 11, veranderden na 8 uur incubatie onder de geteste omstandigheden de piekhoogte, piekbreedte en piekoppervlak van NP RuDA niet significant, wat wijst op uitstekende stabiliteit van NP RuDA.Bovendien toonden TEM-afbeeldingen aan dat de morfologie van de RuDA-NP-nanodeeltjes na 24 uur vrijwel onveranderd bleef in verdunde PBS-buffer (pH = 7, 4, aanvullende figuur 12).
Omdat zelfassemblage verschillende functionele en chemische eigenschappen aan erts kan verlenen, hebben we de afgifte van 9,10-antraceendiylbis(methyleen)dimalonzuur (ABDA, indicator 1O2) waargenomen in methanol-watermengsels.Erts met verschillend watergehalte50.Zoals weergegeven in figuur 2D en aanvullende figuur 13, werd geen afbraak van ABDA waargenomen wanneer het watergehalte lager was dan 20%.Bij een toename van de luchtvochtigheid tot 40% trad ABDA-degradatie op, zoals blijkt uit een afname in de intensiteit van ABDA-fluorescentie.Er is ook waargenomen dat een hoger watergehalte resulteert in een snellere afbraak, wat suggereert dat zelfassemblage van RuDA noodzakelijk en gunstig is voor de afbraak van ABDA.Dit fenomeen is heel anders dan moderne ACQ-chromoforen (aggregatie-geïnduceerde uitdoving).Bij bestraling met een laser met een golflengte van 808 nm is de kwantumopbrengst van 1O2 RuDA in een mengsel van 98% H2O/2% DMF 16,4%, wat 82 keer hoger is dan die van ICG (ΦΔ = 0,2%)51, het aantonen van een opmerkelijke generatie efficiëntie 1O2 RuDA in de staat van aggregatie.
Elektronenspins met 2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidinon (TEMP) en 5,5-dimethyl-1-pyrroline N-oxide (DMPO) als spin-traps Resonantiespectroscopie (ESR) werd gebruikt om de resulterende soort te identificeren AFK.door RuDA.Zoals weergegeven in aanvullende figuur 14, is bevestigd dat 1O2 wordt gegenereerd bij bestralingstijden tussen 0 en 4 minuten.Bovendien werd, wanneer RuDA werd geïncubeerd met DMPO onder bestraling, een typisch vierregelig EPR-signaal van 1:2:2:1 DMPO-OH-adduct gedetecteerd, wat wijst op de vorming van hydroxylradicalen (OH-).Over het algemeen demonstreren de bovenstaande resultaten het vermogen van RuDA om de ROS-productie te stimuleren via een dubbel type I/II fotosensibilisatieproces.
Om de elektronische eigenschappen van RuDA in monomere en geaggregeerde vormen beter te begrijpen, werden de grensmoleculaire orbitalen van RuDA in monomere en dimere vormen berekend met behulp van de DFT-methode.Zoals getoond in afb.3A, is de hoogste bezette moleculaire orbitaal (HOMO) van monomeer RuDA gedelokaliseerd langs de ligandruggengraat en de laagste onbezette moleculaire orbitaal (LUMO) is gecentreerd op de TDP-acceptoreenheid.Integendeel, de elektronendichtheid in het dimere HOMO is geconcentreerd op het ligand van één RuDA-molecuul, terwijl de elektronendichtheid in het LUMO voornamelijk geconcentreerd is op de acceptoreenheid van een ander RuDA-molecuul, wat aangeeft dat RuDA in het dimeer zit.Kenmerken van CT.
A De HOMO en LUMO van erts worden berekend in monomere en dimere vormen.B Singlet- en triplet-energieniveaus van erts in monomeren en dimeren.C Geschatte niveaus van RuDA en mogelijke ISC-kanalen als monomeer C en dimere D. Pijlen geven mogelijke ISC-kanalen aan.
De verdeling van elektronen en gaten in de aangeslagen toestanden van RuDA met lage energie singlet in de monomere en dimere vormen werd geanalyseerd met behulp van de Multiwfn 3.852.53-software, die werd berekend met behulp van de TD-DFT-methode.Zoals aangegeven op het extra etiket.Zoals getoond in figuren 1-2, zijn monomere RDA-gaten meestal gedelokaliseerd langs de ligandruggengraat in deze singlet-geëxciteerde toestanden, terwijl elektronen zich meestal in de TDP-groep bevinden, wat de intramoleculaire kenmerken van CT aantoont.Bovendien is er voor deze singlet-aangeslagen toestanden min of meer overlap tussen gaten en elektronen, wat suggereert dat deze aangeslagen singlet-toestanden een bijdrage leveren van lokale excitatie (LE).Voor dimeren werd, naast intramoleculaire CT- en LE-kenmerken, een bepaald deel van intermoleculaire CT-kenmerken waargenomen in de respectievelijke staten, met name S3, S4, S7 en S8, op basis van intermoleculaire CT-analyse, met CT-intermoleculaire overgangen als de belangrijkste. (Aanvullende tabel).3).
Om de experimentele resultaten beter te begrijpen, hebben we de eigenschappen van RuDA-aangeslagen toestanden verder onderzocht om de verschillen tussen monomeren en dimeren te onderzoeken (aanvullende tabellen 4-5).Zoals weergegeven in figuur 3B, zijn de energieniveaus van de singlet- en triplet-aangeslagen toestanden van het dimeer veel dichter dan die van het monomeer, wat helpt om de energiekloof tussen S1 en Tn te verkleinen. Er is gemeld dat de ISC-overgangen kunnen worden gerealiseerd binnen een kleine energiekloof (ΔES1-Tn <0,3 eV) tussen S1 en Tn54. Er is gemeld dat de ISC-overgangen kunnen worden gerealiseerd binnen een kleine energiekloof (ΔES1-Tn <0,3 eV) tussen S1 en Tn54. ообщалось, о переходы ISC огут реализованы в пределах небольшой энергетической щели (ΔES1-Tn <0,3 ) en Tn S.1 Er is gemeld dat ISC-overgangen kunnen worden gerealiseerd binnen een kleine energiekloof (ΔES1-Tn <0,3 eV) tussen S1 en Tn54.据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙（ΔES1-Tn < 0,3 eV）内实现。据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙（ΔES1-Tn < 0,3 eV）内实现。 ообщалось, о переход ISC ожет быть реализован в пределах небольшой энергетической ели (ΔES1-Tn < 0,354 эВ) е S.1 Er is gemeld dat de ISC-overgang kan worden gerealiseerd binnen een kleine energiekloof (ΔES1-Tn <0,3 eV) tussen S1 en Tn54.Bovendien mag slechts één orbitaal, bezet of onbezet, verschillen in gebonden singlet- en triplettoestanden om een ​​SOC-integraal te verkrijgen die niet nul is.Dus, op basis van de analyse van de excitatie-energie en de orbitale overgang, worden alle mogelijke kanalen van de ISC-overgang getoond in Fig.3C,D.Met name is er slechts één ISC-kanaal beschikbaar in het monomeer, terwijl de dimere vorm vier ISC-kanalen heeft die de ISC-overgang kunnen verbeteren.Daarom is het redelijk om aan te nemen dat hoe meer RuDA-moleculen worden geaggregeerd, hoe toegankelijker de ISC-kanalen zullen zijn.Daarom kunnen RuDA-aggregaten tweebands elektronische structuren vormen in de singlet- en triplet-toestanden, waardoor de energiekloof tussen S1 en beschikbare Tn wordt verkleind, waardoor de efficiëntie van ISC wordt verhoogd om de opwekking van 1O2 te vergemakkelijken.
Om het onderliggende mechanisme verder op te helderen, hebben we een referentieverbinding van het areen-Ru (II) -complex (RuET) gesynthetiseerd door twee ethylgroepen te vervangen door twee trifenylamine-fenylgroepen in RuDA (Fig. 4A, voor volledige karakterisering, zie ESI, Aanvullend 15). -21 ) Van donor (diethylamine) tot acceptor (TDF), RuET heeft dezelfde intramoleculaire CT-kenmerken als RuDA.Zoals verwacht vertoonde het absorptiespectrum van RuET in DMF een ladingsoverdrachtsband met lage energie met sterke absorptie in het nabij-infraroodgebied in het gebied van 600-1100 nm (figuur 4B).Bovendien werd RuET-aggregatie ook waargenomen met toenemend watergehalte, wat tot uiting kwam in de roodverschuiving van het absorptiemaximum, wat verder werd bevestigd door vloeibare AFM-beeldvorming (aanvullende figuur 22).De resultaten laten zien dat RuET, net als RuDA, intramoleculaire toestanden kan vormen en zichzelf kan assembleren tot geaggregeerde structuren.
Chemische structuur van RuET.B Absorptiespectra van RuET in mengsels van verschillende verhoudingen van DMF en water.Plots C EIS Nyquist voor RuDA en RuET.Fotostroomreacties D van RuDA en RuET onder invloed van laserstraling met een golflengte van 808 nm.
De fotodegradatie van ABDA in aanwezigheid van RuET werd geëvalueerd door bestraling met een laser met een golflengte van 808 nm.Verrassend genoeg werd er geen afbraak van ABDA waargenomen in verschillende waterfracties (aanvullende figuur 23).Een mogelijke reden is dat RuET niet efficiënt een gestreepte elektronische structuur kan vormen omdat de ethylketen geen efficiënte intermoleculaire ladingsoverdracht bevordert.Daarom werden elektrochemische impedantiespectroscopie (EIS) en transiënte fotostroommetingen uitgevoerd om de foto-elektrochemische eigenschappen van RuDA en RuET te vergelijken.Volgens de Nyquist-plot (Figuur 4C) vertoont RuDA een veel kleinere straal dan RuET, wat betekent dat RuDA56 sneller intermoleculaire elektronentransport en betere geleidbaarheid heeft.Bovendien is de fotostroomdichtheid van RuDA veel hoger dan die van RuET (Fig. 4D), wat de betere efficiëntie van de ladingsoverdracht van RuDA57 bevestigt.De fenylgroep van trifenylamine in erts speelt dus een belangrijke rol bij het verschaffen van intermoleculaire ladingsoverdracht en de vorming van een gestreepte elektronische structuur.
Om tumoraccumulatie en in vivo biocompatibiliteit te vergroten, hebben we RuDA verder ingekapseld met F127.De gemiddelde hydrodynamische diameter van RuDA-NP's werd bepaald op 123,1 nm met een smalle verdeling (PDI = 0,089) met behulp van de dynamische lichtverstrooiing (DLS) -methode (Figuur 5A), die tumoraccumulatie bevorderde door de permeabiliteit en retentie te vergroten.EPR) effect.De TEM-afbeeldingen toonden aan dat Ore NP's een uniforme bolvorm hebben met een gemiddelde diameter van 86 nm.Met name het absorptiemaximum van RuDA-NP's verscheen bij 800 nm (aanvullende figuur 24), wat aangeeft dat RuDA-NP's de functies en eigenschappen van zelfassemblerende RuDA's kunnen behouden.De berekende ROS-kwantumopbrengst voor NP-erts is 15,9%, wat vergelijkbaar is met erts. De fotothermische eigenschappen van RuDA NP's werden bestudeerd onder invloed van laserstraling met een golflengte van 808 nm met behulp van een infraroodcamera.Zoals getoond in afb.5B,C, de controlegroep (alleen PBS) ervoer een lichte temperatuurstijging, terwijl de temperatuur van de RuDA-NPs-oplossing snel toenam met toenemende temperatuur (ΔT) tot 15,5, 26,1 en 43,0°C.Hoge concentraties waren respectievelijk 25, 50 en 100 µM, wat wijst op een sterk fotothermisch effect van RuDA NP's.Bovendien werden metingen van de verwarmings- / afkoelingscyclus uitgevoerd om de fotothermische stabiliteit van RuDA-NP te evalueren en te vergelijken met ICG.De temperatuur van erts-NP's nam niet af na vijf verwarmings- / afkoelcycli (figuur 5D), wat wijst op de uitstekende fotothermische stabiliteit van erts-NP's.Daarentegen vertoont ICG een lagere fotothermische stabiliteit zoals blijkt uit de schijnbare verdwijning van het fotothermische temperatuurplateau onder dezelfde omstandigheden.Volgens de vorige methode58 werd de fotothermische conversie-efficiëntie (PCE) van RuDA-NP berekend op 24,2%, wat hoger is dan bestaande fotothermische materialen zoals gouden nanostaafjes (21,0%) en gouden nanoschillen (13,0%)59.NP-erts vertoont dus uitstekende fotothermische eigenschappen, waardoor ze veelbelovende PTT-agentia zijn.
Analyse van DLS- en TEM-afbeeldingen van RuDA NP's (inzet).B Warmtebeelden van verschillende concentraties RuDA NP's blootgesteld aan laserstraling bij een golflengte van 808 nm (0,5 W cm-2).C Fotothermische conversiecurven van verschillende concentraties van erts-NP's, die kwantitatieve gegevens zijn.B. D Temperatuurstijging van ORE NP en ICG over 5 verwarmings-koelcycli.
Fotocytotoxiciteit van RuDA NP's tegen MDA-MB-231 menselijke borstkankercellen werd in vitro geëvalueerd.Zoals getoond in afb.6A, B, RuDA-NP's en RuDA vertoonden een verwaarloosbare cytotoxiciteit in afwezigheid van bestraling, wat een lagere donkere toxiciteit van RuDA-NP's en RuDA impliceert.Na blootstelling aan laserstraling bij een golflengte van 808 nm vertoonden RuDA en RuDA NP's echter sterke fotocytotoxiciteit tegen MDA-MB-231 kankercellen met IC50-waarden (half-maximale remmende concentratie) van respectievelijk 5,4 en 9,4 μM, wat aantoont dat RuDA-NP en RuDA potentieel hebben voor fototherapie bij kanker.Bovendien werd de fotocytotoxiciteit van RuDA-NP en RuDA verder onderzocht in aanwezigheid van vitamine C (Vc), een ROS-scavenger, om de rol van ROS in door licht geïnduceerde cytotoxiciteit op te helderen.Het is duidelijk dat de levensvatbaarheid van de cellen toenam na de toevoeging van Vc, en de IC50-waarden van RuDA en RuDA NP's waren respectievelijk 25,7 en 40,0 μM, wat de belangrijke rol van ROS in de fotocytotoxiciteit van RuDA en RuDA NP's bewijst.Door licht geïnduceerde cytotoxiciteit van RuDA-NP's en RuDA in MDA-MB-231 kankercellen door kleuring van levende / dode cellen met behulp van calceïne AM (groene fluorescentie voor levende cellen) en propidiumjodide (PI, rode fluorescentie voor dode cellen).bevestigd door cellen) als fluorescerende sondes.Zoals weergegeven in figuur 6C, bleven cellen die waren behandeld met RuDA-NP of RuDA levensvatbaar zonder bestraling, zoals blijkt uit intense groene fluorescentie.Integendeel, onder laserbestraling werd alleen rode fluorescentie waargenomen, wat de effectieve fotocytotoxiciteit van RuDA of RuDA NP's bevestigt.Het is opmerkelijk dat groene fluorescentie verscheen na toevoeging van Vc, wat wijst op een schending van de fotocytotoxiciteit van RuDA en RuDA NP's.Deze resultaten komen overeen met in vitro fotocytotoxiciteitstesten.
Dosisafhankelijke levensvatbaarheid van A RuDA- en B RuDA-NP-cellen in MDA-MB-231-cellen in aanwezigheid of afwezigheid van respectievelijk Vc (0,5 mM).Foutbalken, gemiddelde ± standaarddeviatie (n = 3). Ongepaarde, tweezijdige t-tests *p < 0,05, **p < 0,01 en ***p < 0,001. Ongepaarde, tweezijdige t-tests *p < 0,05, **p < 0,01 en ***p < 0,001. епарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 en ***p <0,001. Ongepaarde tweezijdige t-toetsen *p<0,05, **p<0,01 en ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。 епарные сторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 en ***p <0,001. Ongepaarde tweezijdige t-toetsen *p<0,05, **p<0,01 en ***p<0,001.C Analyse van de kleuring van levende/dode cellen met behulp van calceïne AM en propidiumjodide als fluorescerende sondes.Schaalbalk: 30 µm.Representatieve afbeeldingen van drie biologische herhalingen van elke groep worden getoond.D Confocale fluorescentiebeelden van ROS-productie in MDA-MB-231-cellen onder verschillende behandelingsomstandigheden.Groene DCF-fluorescentie geeft de aanwezigheid van ROS aan.Bestraal met een laser met een golflengte van 808 nm met een vermogen van 0,5 W/cm2 gedurende 10 minuten (300 J/cm2).Schaalbalk: 30 µm.Representatieve afbeeldingen van drie biologische herhalingen van elke groep worden getoond.E Flowcytometrie RuDA-NP's (50 M) of RuDA (50 M) behandelingsanalyse met of zonder 808 nm laser (0,5 W cm-2) in aanwezigheid en afwezigheid van Vc (0,5 mM) gedurende 10 min.Representatieve afbeeldingen van drie biologische herhalingen van elke groep worden getoond.F Nrf-2, HSP70 en HO-1 van MDA-MB-231-cellen behandeld met RuDA-NP's (50 µM) met of zonder 808 nm laserbestraling (0,5 W cm-2, 10 min, 300 J cm-2), cellen brengen 2) tot expressie.Representatieve beelden van twee biologische herhalingen van elke groep worden getoond.
Intracellulaire ROS-productie in MDA-MB-231-cellen werd onderzocht met behulp van de 2,7-dichloordihydrofluoresceïnediacetaat (DCFH-DA) kleurmethode.Zoals getoond in afb.6D vertoonden cellen behandeld met RuDA-NP's of RuDA een duidelijke groene fluorescentie wanneer ze werden bestraald met de 808 nm-laser, wat aangeeft dat RuDA-NP's en RuDA een efficiënt vermogen hebben om ROS te genereren.Integendeel, in de afwezigheid van licht of in de aanwezigheid van Vc, werd alleen een zwak fluorescerend signaal van de cellen waargenomen, wat wees op een lichte vorming van ROS.Intracellulaire ROS-niveaus in RuDA-NP-cellen en RuDA-behandelde MDA-MB-231-cellen werden verder bepaald door flowcytometrie.Zoals weergegeven in aanvullende figuur 25, was de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) gegenereerd door RuDA-NP's en RuDA onder 808 nm laserbestraling significant verhoogd met respectievelijk ongeveer 5,1 en 4,8 keer in vergelijking met de controlegroep, wat hun uitstekende vorming AFK bevestigt.capaciteit.Intracellulaire ROS-niveaus in RuDA-NP- of MDA-MB-231-cellen behandeld met RuDA waren echter alleen vergelijkbaar met controles zonder laserbestraling of in aanwezigheid van Vc, vergelijkbaar met de resultaten van confocale fluorescentieanalyse.
Er is aangetoond dat mitochondriën het belangrijkste doelwit zijn van Ru(II)-areencomplexen60.Daarom werd de subcellulaire lokalisatie van RuDA en RuDA-NP's onderzocht.Zoals weergegeven in aanvullende figuur 26, vertonen RuDA en RuDA-NP vergelijkbare cellulaire distributieprofielen met de hoogste accumulatie in mitochondriën (respectievelijk 62,5 ± 4,3 en 60,4 ± 3,6 ng/mg eiwit).Er werd echter slechts een kleine hoeveelheid Ru gevonden in de nucleaire fracties van Erts en NP Erts (respectievelijk 3,5 en 2,1%).De resterende celfractie bevatte resterend ruthenium: 31,7% (30,6 ± 3,4 ng/mg eiwit) voor RuDA en 42,9% (47,2 ± 4,5 ng/mg eiwit) voor RuDA-NP's.Over het algemeen worden erts en NP-erts voornamelijk geaccumuleerd in mitochondriën.Om mitochondriale disfunctie te beoordelen, hebben we JC-1 en MitoSOX Red-kleuring gebruikt om respectievelijk het mitochondriale membraanpotentieel en de productiecapaciteit van superoxide te beoordelen.Zoals getoond in aanvullende figuur 27, werd intense groene (JC-1) en rode (MitoSOX Red) fluorescentie waargenomen in cellen die waren behandeld met zowel RuDA als RuDA-NP's onder 808 nm laserbestraling, wat aangeeft dat zowel RuDA als RuDA-NP's zeer fluorescerend zijn Het kan effectief mitochondriale membraandepolarisatie en superoxideproductie induceren.Bovendien werd het mechanisme van celdood bepaald met behulp van op flowcytometrie gebaseerde analyse van annexine V-FITC/propidiumjodide (PI).Zoals weergegeven in figuur 6E, veroorzaakten RuDA en RuDA-NP, wanneer ze werden bestraald met een laser van 808 nm, een significant verhoogde vroege apoptose-snelheid (kwadrant rechtsonder) in MDA-MB-231-cellen in vergelijking met PBS of PBS plus laser.bewerkte cellen.Toen Vc werd toegevoegd, nam de apoptosesnelheid van RuDA en RuDA-NP echter significant af van 50,9% en 52,0% tot respectievelijk 15,8% en 17,8%, wat de belangrijke rol van ROS in de fotocytotoxiciteit van RuDA en RuDA-NP bevestigt..Bovendien werden lichte necrotische cellen waargenomen in alle geteste groepen (kwadrant linksboven), wat suggereert dat apoptose de overheersende vorm van celdood kan zijn die wordt geïnduceerd door RuDA en RuDA-NP's.
Omdat schade door oxidatieve stress een belangrijke determinant is van apoptose, werd de nucleaire factor geassocieerd met erytroïde 2, factor 2 (Nrf2) 62, een belangrijke regulator van het antioxidantsysteem, onderzocht in met RuDA-NP's behandeld MDA-MB-231.Werkingsmechanisme van RuDA NP's geïnduceerd door bestraling.Tegelijkertijd werd ook expressie van het stroomafwaartse eiwit heem-oxygenase 1 (HO-1) gedetecteerd.Zoals weergegeven in figuur 6F en aanvullende figuur 29, verhoogde RuDA-NP-gemedieerde fototherapie de expressieniveaus van Nrf2 en HO-1 in vergelijking met de PBS-groep, wat aangeeft dat RuDA-NP's oxidatieve stress-signaleringsroutes kunnen stimuleren.Om het fotothermische effect van RuDA-NPs63 te bestuderen, werd bovendien ook de expressie van het heat shock-eiwit Hsp70 geëvalueerd.Het is duidelijk dat cellen die werden behandeld met RuDA-NP's + 808 nm laserbestraling een verhoogde expressie van Hsp70 vertoonden in vergelijking met de andere twee groepen, wat een cellulaire respons op hyperthermie weerspiegelt.
De opmerkelijke in vitro resultaten hebben ons ertoe aangezet om de in vivo prestaties van RuDA-NP in naakte muizen met MDA-MB-231-tumoren te onderzoeken.De weefselverdeling van RuDA NP's werd bestudeerd door het gehalte aan ruthenium in de lever, het hart, de milt, de nieren, de longen en de tumoren te bepalen.Zoals getoond in afb.7A verscheen het maximale gehalte aan erts-NP's in normale organen bij de eerste observatietijd (4 uur), terwijl het maximale gehalte 8 uur na injectie in tumorweefsels werd bepaald, mogelijk als gevolg van erts-NP's.EPR-effect van LF.Volgens de distributieresultaten werd de optimale duur van de behandeling met NP-erts 8 uur na toediening genomen.Om het proces van accumulatie van RuDA-NP's op tumorplaatsen te illustreren, werden de fotoakoestische (PA) eigenschappen van RuDA-NP's gevolgd door de PA-signalen van RuDA-NP's op verschillende tijdstippen na injectie op te nemen.Eerst werd het PA-signaal van RuDA-NP in vivo beoordeeld door PA-beelden van een tumorplaats op te nemen na intratumorale injectie van RuDA-NP.Zoals weergegeven in aanvullende figuur 30, vertoonden RuDA-NP's een sterk PA-signaal en was er een positieve correlatie tussen de RuDA-NP-concentratie en de PA-signaalintensiteit (aanvullende figuur 30A).Vervolgens werden in vivo PA-beelden van tumorplaatsen opgenomen na intraveneuze injectie van RuDA en RuDA-NP op verschillende tijdstippen na injectie.Zoals weergegeven in figuur 7B, nam het PA-signaal van RuDA-NP's van de tumorplaats geleidelijk toe met de tijd en bereikte een plateau 8 uur na injectie, consistent met de weefseldistributieresultaten bepaald door ICP-MS-analyse.Met betrekking tot RuDA (aanvullende figuur 30B) verscheen de maximale PA-signaalintensiteit 4 uur na injectie, wat wijst op een snelle snelheid van binnenkomst van RuDA in de tumor.Daarnaast is het excretiegedrag van RuDA en RuDA-NP's onderzocht door de hoeveelheid ruthenium in urine en feces te bepalen met behulp van ICP-MS.De belangrijkste eliminatieroute voor RuDA (aanvullend Fig. 31) en RuDA-NP's (Fig. 7C) is via de feces, en effectieve klaring van RuDA en RuDA-NP's werd waargenomen tijdens de 8-daagse onderzoeksperiode, wat betekent dat RuDA en RuDA-NP's kunnen efficiënt uit het lichaam worden geëlimineerd zonder toxiciteit op de lange termijn.
A. Ex vivo distributie van RuDA-NP in muizenweefsels werd bepaald door het Ru-gehalte (percentage van de toegediende dosis Ru (ID) per gram weefsel) op verschillende tijdstippen na injectie.Gegevens zijn gemiddelde ± standaarddeviatie (n = 3). Ongepaarde, tweezijdige t-tests *p < 0,05, **p < 0,01 en ***p < 0,001. Ongepaarde, tweezijdige t-tests *p < 0,05, **p < 0,01 en ***p < 0,001. епарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 en ***p <0,001. Ongepaarde tweezijdige t-toetsen *p<0,05, **p<0,01 en ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。 епарные сторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 en ***p <0,001. Ongepaarde tweezijdige t-toetsen *p<0,05, **p<0,01 en ***p<0,001.B PA-beelden van in vivo tumorplaatsen bij 808 nm excitatie na intraveneuze toediening van RuDA-NP's (10 µmol kg-1) op verschillende tijdstippen.Na intraveneuze toediening van RuDA NP's (10 µmol kg-1) werd CRu met verschillende tijdsintervallen uitgescheiden uit muizen met urine en feces.Gegevens zijn gemiddelde ± standaarddeviatie (n = 3).
De verwarmingscapaciteit van RuDA-NP in vivo werd ter vergelijking bestudeerd in naakte muizen met MDA-MB-231 en RuDA-tumoren.Zoals getoond in afb.8A en aanvullende Fig. 32, vertoonde de controlegroep (zoutoplossing) minder temperatuurverandering (ΔT ≈ 3 °C) na 10 minuten continue blootstelling.De temperatuur van RuDA-NP's en RuDA nam echter snel toe met maximale temperaturen van respectievelijk 55,2 en 49,9 ° C, wat voldoende hyperthermie opleverde voor in vivo kankertherapie.De waargenomen toename in hoge temperatuur voor RuDA NP's (ΔT 24°C) in vergelijking met RuDA (ΔT ≈ 19°C) kan te wijten zijn aan de betere permeabiliteit en accumulatie in tumorweefsels als gevolg van het EPR-effect.
Infrarood thermische beelden van muizen met MDA-MB-231 tumoren bestraald met 808 nm laser op verschillende tijdstippen 8 uur na injectie.Representatieve afbeeldingen van vier biologische herhalingen van elke groep worden getoond.B Relatief tumorvolume en C Gemiddelde tumormassa van verschillende groepen muizen tijdens behandeling.D Curven van lichaamsgewichten van verschillende groepen muizen.Bestraal met een laser met een golflengte van 808 nm met een vermogen van 0,5 W/cm2 gedurende 10 minuten (300 J/cm2).Foutbalken, gemiddelde ± standaarddeviatie (n = 3). Ongepaarde, tweezijdige t-tests *p < 0,05, **p < 0,01 en ***p < 0,001. Ongepaarde, tweezijdige t-tests *p < 0,05, **p < 0,01 en ***p < 0,001. епарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 en ***p <0,001. Ongepaarde tweezijdige t-toetsen *p<0,05, **p<0,01 en ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。 епарные сторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 en ***p <0,001. Ongepaarde tweezijdige t-toetsen *p<0,05, **p<0,01 en ***p<0,001. E H & E-kleuring van afbeeldingen van belangrijke organen en tumoren uit verschillende behandelingsgroepen, waaronder Saline, Saline + Laser, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NP's en RuDA-NP's + Laser-groepen. E H & E-kleuring van afbeeldingen van belangrijke organen en tumoren uit verschillende behandelingsgroepen, waaronder Saline, Saline + Laser, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NP's en RuDA-NP's + Laser-groepen. Изображения окрашивания E H&E основных органов и опухолей из разных групп лечения, включая группы физиологического раствора, физиологического раствора + лазера, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs и RuDA-NPs + Laser. E H & E-kleuring van afbeeldingen van belangrijke organen en tumoren uit verschillende behandelingsgroepen, waaronder zoutoplossing, zoutoplossing + laser, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NP's en RuDA-NP's + lasergroepen.来自不同治疗组的主要器官和肿瘤的E H&E 染色图像，包括盐水、盐水+ 激光、RuDA、RuDA + 激光、RuDA-NPs 和RuDA-NPs + 激光组。E H&E ашивание E H&E основных органов и опухолей из различных групп лечения, включая физиологический раствор, физиолиичеаси E H&E-kleuring van belangrijke organen en tumoren van verschillende behandelingsgroepen, waaronder zoutoplossing, zoutoplossing + laser, RuDA, RuDA + laser, RuDA-NP's en RuDA-NP's + laser.Schaalbalk: 60 µm.
Het effect van fototherapie in vivo met RuDA en RuDA NP's werd geëvalueerd waarbij naakte muizen met MDA-MB-231 tumoren intraveneus werden geïnjecteerd met RuDA of RuDA NP's in een enkele dosis van 10,0 µmol kg-1 via de staartader, en vervolgens 8 uur na injectie.laserbestraling met een golflengte van 808 nm.Zoals getoond in figuur 8B, waren de tumorvolumes significant verhoogd in de zout- en lasergroepen, wat aangeeft dat bestraling met zoutoplossing of laser 808 weinig effect had op de tumorgroei.Net als in de zoutgroep werd snelle tumorgroei ook waargenomen bij muizen die werden behandeld met RuDA-NP's of RuDA in afwezigheid van laserbestraling, wat hun lage donkere toxiciteit aantoont.Daarentegen induceerden zowel RuDA-NP- als RuDA-behandeling na laserbestraling significante tumorregressie met tumorvolumeverminderingen van respectievelijk 95,2% en 84,3%, vergeleken met de met zoutoplossing behandelde groep, wat wijst op uitstekende synergetische PDT., gemedieerd door het RuDA/CHTV-effect.– NP of Ore In vergelijking met RuDA vertoonden RuDA NP's een beter fototherapeutisch effect, wat voornamelijk te wijten was aan het EPR-effect van RuDA NP's.Resultaten van tumorgroeiremming werden verder beoordeeld door tumorgewicht uitgesneden op dag 15 van de behandeling (Fig. 8C en Aanvullende Fig. 33).De gemiddelde tumormassa in met RuDA-NP behandelde muizen en met RuDA behandelde muizen was respectievelijk 0,08 en 0,27 g, wat veel lichter was dan in de controlegroep (1,43 g).
Bovendien werd het lichaamsgewicht van muizen om de drie dagen geregistreerd om de donkere toxiciteit van RuDA-NP's of RuDA in vivo te bestuderen.Zoals getoond in figuur 8D werden er geen significante verschillen in lichaamsgewicht waargenomen voor alle behandelingsgroepen. Verder werd de hematoxyline- en eosine (H&E) kleuring van de belangrijkste organen (hart, lever, milt, long en nier) van verschillende behandelingsgroepen ondernomen. Verder werd de hematoxyline- en eosine (H&E) kleuring van de belangrijkste organen (hart, lever, milt, long en nier) van verschillende behandelingsgroepen uitgevoerd. оме того, было проведено окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (сердца, печени,е иоксилином и эозином (H&E) Bovendien werd kleuring met hematoxyline en eosine (H&E) van belangrijke organen (hart, lever, milt, longen en nieren) van verschillende behandelingsgroepen uitgevoerd.此外，对不同治疗组的主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）进行苏木精和伊红(H&E) 染色。 (HIJ) оме того, проводили окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (сердца, печени, сеиезегкенки, аеи, сеиезегкенк Bovendien werd kleuring met hematoxyline en eosine (H&E) van belangrijke organen (hart, lever, milt, long en nier) uitgevoerd in verschillende behandelingsgroepen.Zoals getoond in afb.8E, vertonen de H & E-kleuringsbeelden van vijf belangrijke organen van de RuDA-NP's en RuDA-groepen geen duidelijke afwijkingen of orgaanschade. 8E, vertonen de H & E-kleuringsbeelden van vijf belangrijke organen van de RuDA-NP's en RuDA-groepen geen duidelijke afwijkingen of orgaanschade.Zoals getoond in afb.8E, изображения окрашивания H&E и основных органов из RuDA-NPs en RuDA е демонстрируют явных аномалий или повреждени . 8E, H&E-kleuringsbeelden van vijf belangrijke organen van de RuDA-NP's en RuDA-groepen vertonen geen duidelijke orgaanafwijkingen of laesies.如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E 染色图像没有显示出明显的异常或器官损伤。如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E ак показано на рисунке 8E, изображения окрашивания H&E и основных органов из RuDA-NPs en RuDA не показаниа ий . Zoals weergegeven in figuur 8E, vertoonden H & E-kleuringsbeelden van de vijf belangrijkste organen van de RuDA-NP's en RuDA-groepen geen duidelijke afwijkingen of orgaanschade.Deze resultaten toonden aan dat noch RuDA-NP noch RuDA in vivo tekenen van toxiciteit vertoonden. Bovendien toonden H&E-kleuringsbeelden van tumoren aan dat zowel de RuDA + Laser- als RuDA-NP's + Laser-groepen ernstige vernietiging van kankercellen kunnen veroorzaken, wat de uitstekende in vivo fototherapeutische werkzaamheid van RuDA en RuDA-NP's aantoont. Bovendien toonden H&E-kleuringsbeelden van tumoren aan dat zowel de RuDA + Laser- als RuDA-NP's + Laser-groepen ernstige vernietiging van kankercellen kunnen veroorzaken, wat de uitstekende in vivo fototherapeutische werkzaamheid van RuDA en RuDA-NP's aantoont.Bovendien toonden met hematoxyline-eosine gekleurde tumorbeelden aan dat zowel RuDA+Laser- als RuDA-NPs+Laser-groepen ernstige vernietiging van kankercellen kunnen veroorzaken, wat de superieure fototherapeutische werkzaamheid van RuDA en RuDA-NPs in vivo aantoont.此外，肿瘤的H&E 染色图像显示，RuDA + Laser 和RuDA-NPs + Laser 组均可导致严重的癌细胞破坏，证明了RuDA 和RuDA-NPs 的优异的体内光疗功效。此外 ， 肿瘤 的 & e 染色 显示 ， ruda + laser 和 ruda-nps + laser 组均 导致 的 癌细胞 破坏 ， 证明 了 ruda 和 ruda-nps 的 的 体内 光疗。。。。。。。。。。。。。 ikBovendien toonden met hematoxyline en eosine gekleurde tumorbeelden aan dat zowel RuDA+Laser- als RuDA-NPs+Laser-groepen resulteerden in ernstige vernietiging van kankercellen, wat een superieure fototherapeutische werkzaamheid van RuDA en RuDA-NPs in vivo aantoont.
Concluderend werd het Ru(II)-areen (RuDA) organometaalcomplex met DA-type liganden ontworpen om het ISC-proces te vergemakkelijken met behulp van de aggregatiemethode.Gesynthetiseerd RuDA kan zichzelf assembleren door middel van niet-covalente interacties om van RuDA afgeleide supramoleculaire systemen te vormen, waardoor de vorming van 1O2 en efficiënte fotothermische conversie voor door licht geïnduceerde kankertherapie wordt vergemakkelijkt.Het is opmerkelijk dat monomeer RuDA geen 1O2 genereerde onder laserbestraling bij 808 nm, maar een grote hoeveelheid 1O2 in geaggregeerde toestand kon genereren, wat de rationaliteit en efficiëntie van ons ontwerp aantoont.Daaropvolgende studies hebben aangetoond dat de supramoleculaire assemblage RuDA verbeterde fotofysische en fotochemische eigenschappen geeft, zoals roodverschuivingsabsorptie en fotobleekweerstand, die zeer wenselijk zijn voor PDT- en PTT-verwerking.Zowel in vitro als in vivo experimenten hebben aangetoond dat RuDA NP's met goede biocompatibiliteit en goede accumulatie in de tumor uitstekende door licht geïnduceerde antikankeractiviteit vertonen bij laserbestraling bij een golflengte van 808 nm.Zo zullen RuDA NP's als effectieve bimodale supramoleculaire PDT / PTW-reagentia de set fotosensitizers die geactiveerd zijn bij golflengten boven 800 nm verrijken.Het conceptuele ontwerp van het supramoleculaire systeem biedt een efficiënte route voor NIR-geactiveerde fotosensitizers met uitstekende fotosensibiliserende effecten.
Alle chemicaliën en oplosmiddelen werden verkregen van commerciële leveranciers en gebruikt zonder verdere zuivering.RuCl3 werd gekocht van Boren Precious Metals Co., Ltd. (Kunming, China).[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-fenantroline-5,6-dion) en 4,7-bis[4-(N,N-difenylamino)fenyl]-5 ,6-Diamino-2,1,3-benzothiadiazool werd gesynthetiseerd volgens eerdere studies64,65.NMR-spectra werden opgenomen op een Bruker Avance III-HD 600 MHz spectrometer bij het Southeastern University Analytical Test Center met gebruikmaking van d6-DMSO of CDC13 als oplosmiddel.Chemische verschuivingen δ worden gegeven in ppm.met betrekking tot tetramethylsilaan, en de interactieconstanten J worden gegeven in absolute waarden in hertz.Hoge resolutie massaspectrometrie (HRMS) werd uitgevoerd op een Agilent 6224 ESI/TOF MS-instrument.Elementanalyse van C, H en N werd uitgevoerd op een Vario MICROCHNOS-elementanalyser (Elementar).UV-zichtbare spectra werden gemeten op een Shimadzu UV3600 spectrofotometer.Fluorescentiespectra werden opgenomen op een Shimadzu RF-6000 spectrofluorimeter.EPR-spectra werden opgenomen op een Bruker EMXmicro-6/1-instrument.De morfologie en structuur van de voorbereide monsters werden bestudeerd op FEI Tecnai G20 (TEM) en Bruker Icon (AFM) instrumenten die werken op een spanning van 200 kV.Dynamische lichtverstrooiing (DLS) werd uitgevoerd op een Nanobrook Omni-analysator (Brookhaven).Foto-elektrochemische eigenschappen werden gemeten op een elektrochemische opstelling (CHI-660, China).Fotoakoestische beelden werden verkregen met behulp van het FUJIFILM VisualSonics Vevo® LAZR-systeem.Confocale beelden werden verkregen met behulp van een Olympus FV3000 confocale microscoop.FACS-analyse werd uitgevoerd op een BD Calibur-flowcytometer.Experimenten met hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) werden uitgevoerd op een Waters Alliance e2695-systeem met behulp van een 2489 UV/Vis-detector.Gelpermeatiechromatografie (GPC)-tests werden geregistreerd op een Thermo ULTIMATE 3000-instrument met behulp van een ERC RefratoMax520-brekingsindexdetector.
[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-fenantroline-5,6-dion)64 (481,0 mg, 1,0 mmol), 4,7-bis[4 -(N, N-difenylamino)fenyl]-5,6-diamino-2,1,3-benzothiadiazool 65 (652,0 mg, 1,0 mmol) en ijsazijn (30 ml) werden 12 uur geroerd bij refluxkoelkast.Het oplosmiddel werd vervolgens onder vacuüm verwijderd met behulp van een roterende verdamper.Het resulterende residu werd gezuiverd door middel van flash-kolomchromatografie (silicagel, CH2C12:MeOH=20:1) om RuDA te verkrijgen als een groen poeder (opbrengst: 877,5 mg, 80%).anus.Berekend voor C64H48C12N8RuS: C 67,84, H 4,27, N 9,89.Gevonden: C 67,92, H 4,26, N 9,82.1H NMR (600 MHz, d6-DMSO) δ 10,04 (s, 2H), 8,98 (s, 2H), 8,15 (s, 2H), 7,79 (s, 4H), 7,44 (s, 8H), 7,21 (d, J = 31,2 Hz, 16H), 6,47 (s, 2H), 6,24 (s, 2H), 2,69 (s, 1H), 2,25 (s, 3H), 0,99 (s, 6H).13c nmr (150 MHZ, D6-DMSO), δ (PPM) 158.03, 152.81, 149.31, 147.98, 147.16, 139.98, 136.21, 135.57, 134.68, 130.34, 130.02, 128.68, 128.01, 125.51, 124.45, 12049,81103, 103. , 103. , 86.52, 84.75, 63.29, 30.90, 22.29, 18.83.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 1097,25.
Synthese van 4,7-bis[4-(N,N-diethylamino)fenyl-5,6-diamino-2,1,3-benzothiadiazool (L2): L2 werd in twee stappen gesynthetiseerd.Pd(PPh3)4 (46 mg, 0,040 mmol) werd toegevoegd aan N,N-diethyl-4-(tributylstannyl)aniline (1,05 g, 2,4 mmol) en 4,7-dibroom-5,6-dinitro-oplossing - 2, 1,3-benzothiadiazool (0,38 g, 1,0 mmol) in droge tolueen (100 ml).Het mengsel werd 24 uur bij 100°C geroerd.Na verwijdering van het tolueen onder vacuüm werd de resulterende vaste stof gewassen met petroleumether.Vervolgens werd een mengsel van deze verbinding (234,0 mg, 0,45 mmol) en ijzerpoeder (0,30 g, 5,4 mmol) in azijnzuur (20 ml) 4 uur bij 80°C geroerd.Het reactiemengsel werd in water gegoten en de resulterende bruine vaste stof werd door filtratie verzameld.Het product werd tweemaal gezuiverd door vacuümsublimatie om een ​​groene vaste stof op te leveren (126,2 mg, 57% opbrengst).anus.Berekend voor C26H32N6S: C 67,79, H 7,00, N 18,24.Gevonden: C 67.84, H 6.95, H 18.16.1H NMR (600 MHz, CDC13), 8 (ppm) 7,42 (d, 4H), 6,84 (d, 4H), 4,09 (s, 4H), 3,42 (d, 8H), 1,22 (s, 12H).13a NMR (150 MHz, CDC13), 8 (ppm) 151,77, 147,39, 138,07, 131,20, 121,09, 113,84, 111,90, 44,34, 12,77.ESI-MS: m/z [M+H]+ = 461,24.
Verbindingen werden bereid en gezuiverd volgens procedures vergelijkbaar met RuDA.anus.Berekend voor C48H48C12N8RuS: C 61,27, H 5,14, N 11,91.Gevonden: C, 61,32, H, 5,12, N, 11,81,1H NMR (600 MHz, d6-DMSO), δ (ppm) 10,19 (s, 2H), 9,28 (s, 2H), 8,09 (s, 2H), 7,95 (s, 4H), 6,93 (s, 4H), 6,48 (d, 2H), 6,34 (s, 2H), 3,54 (t, 8H), 2,80 (m, 1H), 2,33 (s, 3H), 1,31 (t, 12H), 1,07 (s, 6H).13c NMR (151 MHz, CDCL3), δ (PPM) 158.20, 153.36, 148.82, 148.14, 138.59, 136.79, 135.75, 134.71, 130.44, 128.87, 128.35, 121.70, 111.84, 110.76, 105.07, 104.23, 87.0,8.4.4., 38.06, 31.22, 29.69, 22.29, 19.19, 14.98, 12.93.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 905,24.
RuDA werd opgelost in MeOH/H20 (5/95, v/v) in een concentratie van 10 M.Het absorptiespectrum van RuDA werd elke 5 minuten gemeten op een Shimadzu UV-3600 spectrofotometer onder bestraling met laserlicht met een golflengte van 808 nm (0,5 W/cm2).De ICG-spectra werden opgenomen onder dezelfde omstandigheden als de standaard.
De EPR-spectra zijn opgenomen op een Bruker EMXmicro-6/1-spectrometer met een microgolfvermogen van 20 mW, een scanbereik van 100 G en een veldmodulatie van 1 G. 2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidon (TEMP) en 5,5-dimethyl-1-pyrroline N-oxide (DMPO) werden gebruikt als spinvallen.Elektronenspinresonantiespectra werden opgenomen voor gemengde oplossingen van RuDA (50 µM) en TEMF (20 mM) of DMPO (20 mM) onder invloed van laserstraling met een golflengte van 808 nm (0,5 W/cm2).
DFT- en TD-DFT-berekeningen voor RuDA werden uitgevoerd op PBE1PBE/6-31 G*//LanL2DZ-niveaus in waterige oplossing met behulp van het Gauss-programma 1666,67,68.De HOMO-LUMO-, gat- en elektronenverdelingen van de RuDA-aangeslagen toestand met lage energie singlet werden uitgezet met behulp van het GaussView-programma (versie 5.0).
We hebben eerst geprobeerd de generatie-efficiëntie van 1O2 RuDA te meten met behulp van conventionele UV-zichtbare spectroscopie met ICG (ΦΔ = 0,002) als standaard, maar de fotodegradatie van ICG had een sterke invloed op de resultaten.Zo werd de kwantumopbrengst van 1O2 RuDA gemeten door een verandering in de intensiteit van ABDA-fluorescentie te detecteren bij ongeveer 428 nm bij bestraling met een laser met een golflengte van 808 nm (0,5 W/cm2).Experimenten werden uitgevoerd op RuDA en RuDA NP's (20 M) in water/DMF (98/2, v/v) met ABDA (50 M).De kwantumopbrengst van 1O2 werd berekend met de volgende formule: ΦΔ (PS) = ΦΔ (ICG) × (rFS/APS)/(rICG/AICG).rPS en rICG zijn de reactiesnelheden van ABDA met 1O2 verkregen uit respectievelijk de fotosensitizer en ICG.APS en AICG zijn respectievelijk de absorptie van de fotosensitizer en ICG bij 808 nm.
AFM-metingen werden uitgevoerd in vloeibare omstandigheden met behulp van de scanmodus op een Bruker Dimension Icon AFM-systeem.Met behulp van een open structuur met vloeibare cellen werden de cellen tweemaal gewassen met ethanol en gedroogd met een stroom stikstof.Plaats de gedroogde cellen in de optische kop van de microscoop.Plaats onmiddellijk een druppel van het monster in de plas vloeistof en plaats deze op de cantilever met behulp van een steriele plastic wegwerpspuit en een steriele naald.Een andere druppel wordt direct op het monster geplaatst en wanneer de optische kop wordt neergelaten, smelten de twee druppels samen en vormen ze een meniscus tussen het monster en het vloeistofreservoir.AFM-metingen werden uitgevoerd met behulp van een SCANASYST-FLUID V-vormige nitride-cantilever (Bruker, hardheid k = 0,7 Nm-1, f0 = 120-180 kHz).
HPLC-chromatogrammen werden verkregen op een Waters e2695-systeem uitgerust met een phoenix C18-kolom (250 x 4,6 mm, 5 µm) met gebruikmaking van een 2489 UV/Vis-detector.De golflengte van de detector is 650 nm.Mobiele fasen A en B waren respectievelijk water en methanol, en de stroomsnelheid van de mobiele fase was 1,0 ml.min-1.De gradiënt (oplosmiddel B) was als volgt: 100% van 0 tot 4 minuten, 100% tot 50% van 5 tot 30 minuten, en teruggezet naar 100% van 31 tot 40 minuten.Erts werd opgelost in een gemengde oplossing van methanol en water (50/50, per volume) bij een concentratie van 50 M.Het injectievolume was 20 l.
GPC-assays werden opgenomen op een Thermo ULTIMATE 3000-instrument uitgerust met twee PL aquagel-OH MIXED-H-kolommen (2 x 300 x 7,5 mm, 8 µm) en een ERC RefratoMax520 brekingsindexdetector.De GPC-kolom werd geëlueerd met water met een stroomsnelheid van 1 ml/min bij 30°C.Erts-NP's werden opgelost in PBS-oplossing (pH = 7,4, 50 M), het injectievolume was 20 L.
Fotostromen werden gemeten op een elektrochemische opstelling (CHI-660B, China).De opto-elektronische reacties bij het in- en uitschakelen van de laser (808 nm, 0,5 W/cm2) werden respectievelijk gemeten bij een spanning van 0,5 V in een zwarte doos.Een standaard cel met drie elektroden werd gebruikt met een L-vormige glasachtige koolstofelektrode (GCE) als werkelektrode, een standaard calomelelektrode (SCE) als referentie-elektrode en een platinaschijf als tegenelektrode.Als elektrolyt werd een 0,1 M Na2S04-oplossing gebruikt.
De humane borstkankercellijn MDA-MB-231 werd gekocht bij KeyGEN Biotec Co., LTD (Nanjing, China, catalogusnummer: KG033).Cellen werden gekweekt in monolagen in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, hoge glucose) aangevuld met een oplossing van 10% foetaal runderserum (FBS), penicilline (100 g/ml) en streptomycine (100 g/ml).Alle cellen werden gekweekt bij 37°C in een vochtige atmosfeer die 5% CO2 bevatte.
De MTT-assay werd gebruikt om de cytotoxiciteit van RuDA en RuDA-NP's te bepalen in aanwezigheid en afwezigheid van bestraling met licht, met of zonder Vc (0,5 mM).MDA-MB-231 kankercellen werden gekweekt in platen met 96 putjes bij een celdichtheid van ongeveer 1 x 105 cellen/ml/putje en gedurende 12 uur bij 37,0°C in een atmosfeer van 5% CO2 en 95% lucht geïncubeerd.RuDA en RuDA NP's opgelost in water werden aan de cellen toegevoegd.Na 12 uur incubatie werden de cellen blootgesteld aan 0,5 W cm-2 laserstraling bij een golflengte van 808 nm gedurende 10 minuten (300 J cm-2) en vervolgens 24 uur in het donker geïncubeerd.De cellen werden vervolgens nog 5 uur met MTT (5 mg/ml) geïncubeerd.Verander ten slotte het medium in DMSO (200 ul) om de resulterende paarse formazankristallen op te lossen.OD-waarden werden gemeten met een microplaatlezer met een golflengte van 570/630 nm.De IC50-waarde voor elk monster werd berekend met behulp van de SPSS-software uit dosis-responscurves verkregen uit ten minste drie onafhankelijke experimenten.
MDA-MB-231-cellen werden behandeld met RuDA en RuDA-NP in een concentratie van 50 M.Na 12 uur incubatie werden de cellen bestraald met een laser met een golflengte van 808 nm en een vermogen van 0,5 W/cm2 gedurende 10 min (300 J/cm2).In de vitamine C (Vc)-groep werden cellen voorafgaand aan laserbestraling behandeld met 0,5 mM Vc.Cellen werden vervolgens nog eens 24 uur in het donker geïncubeerd, vervolgens gekleurd met calceïne AM en propidiumjodide (20 g/ml, 5 l) gedurende 30 minuten, daarna gewassen met PBS (10 l, pH 7,4).afbeeldingen van gekleurde cellen.