Nieuws

Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com.De browserversie die u gebruikt, heeft beperkte CSS-ondersteuning.Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen).Om voortdurende ondersteuning te garanderen, zullen we de site in de tussentijd weergeven zonder stijlen en JavaScript.
Enzymatische proximity-labelingsmethoden op basis van geactiveerde esters of fenoxyradicalen worden veel gebruikt om subcellulaire proteomen en eiwitinteractoren in levende cellen in kaart te brengen.Geactiveerde esters zijn echter minder reactief, wat resulteert in een brede labelingsradius, en fenoxyradicalen die worden gegenereerd door peroxidebehandeling kunnen de redoxroutes verstoren.Hier rapporteren we een proximity-labeling-afhankelijke fotoactivatie (PDPL) -methode die is ontwikkeld door het miniSOG-fotosensitizer-eiwit genetisch te koppelen aan een eiwit van belang.Getriggerd door blauw licht en gecontroleerd door de blootstellingstijd, wordt singlet-zuurstof gegenereerd en vervolgens wordt de tijdruimtelijk opgeloste labeling van histidineresiduen door de aniline-sonde bereikt.We demonstreren de hoge betrouwbaarheid ervan door middel van organel-specifieke proteoommapping.Een zij-aan-zij vergelijking van PDPL met TurboID toont een meer specifieke en uitgebreide proteomische dekking van PDPL.Vervolgens pasten we PDPL toe op de ziekte-geassocieerde transcriptionele co-activator BRD4 en E3 Parkin-ligase en vonden we voorheen onbekende interactoren.Door screening op overexpressie werden twee onbekende substraten, Ssu72 en SNW1, geïdentificeerd voor Parkine, waarvan de afbraak wordt gemedieerd door de ubiquitinatie-proteasoomroute.
Nauwkeurige karakterisering van eiwitnetwerken ligt ten grondslag aan veel fundamentele cellulaire processen.Daarom zal zeer nauwkeurige tijdsruimtelijke mapping van eiwitinteracties een moleculaire basis bieden voor het ontcijferen van biologische routes, ziektepathologie en het verstoren van deze interacties voor therapeutische doeleinden.Daartoe zijn werkwijzen die in staat zijn om tijdelijke interacties in levende cellen of weefsels te detecteren, zeer wenselijk.Affiniteitszuivering massaspectrometrie (AP-MS) is van oudsher gebruikt om bindingspartners van eiwitten van belang (POI's) te identificeren.Met de ontwikkeling van kwantitatieve proteomics-methoden werd Bioplex3.0 gecreëerd, de grootste database van eiwitnetwerken op basis van AP-MS.Hoewel AP-MS zeer krachtig is, zijn de cellysis- en verdunningsstappen in de workflow bevooroordeeld in de richting van zwakke en voorbijgaande bindingsinteracties en introduceren ze post-lysis-artefacten zoals valse interactieparen die vóór lysis geen compartimentering hebben.
Om deze problemen aan te pakken, zijn onnatuurlijke aminozuren (UAA) met crosslinking-groepen en enzymatische nabijgelegen labeling (PL)-platforms (bijv. APEX en BioID)5 ontwikkeld.Hoewel de UAA-methode in veel scenario's met succes is toegepast en informatie geeft over directe eiwitkleefstoffen, is optimalisatie van de UAA-insertieplaats nog steeds vereist.Wat nog belangrijker is, het is een stoichiometrische labelingsmethode die een katalytische omkering van labelingsgebeurtenissen mist.Daarentegen fuseren enzymatische PL-methoden, zoals de BioID-methode, het gemanipuleerde biotine-ligase met POI7, dat vervolgens biotine activeert om een ​​reactief biotinyl-AMP-estertussenproduct te vormen.Het enzym katalyseert en geeft dus een geactiveerde biotine-"wolk" af die proximale lysineresten labelt.BioID heeft echter meer dan 12 uur nodig om een ​​voldoende gelabeld signaal te verkrijgen, wat het gebruik ervan met tijdelijke resolutie uitsluit.Met behulp van gerichte evolutie op basis van gistweergave, werd TurboID ontworpen op basis van BioID om efficiënter te zijn, waardoor een efficiënte labeling met biotine binnen 10 minuten mogelijk is, waardoor meer dynamische processen kunnen worden bestudeerd.Omdat TurboID zeer actief is en endogene biotineniveaus voldoende zijn voor labeling op laag niveau, wordt achtergrondlabeling een potentieel probleem wanneer sterk verbeterde en getimede labeling vereist is door de toevoeging van exogeen biotine.Bovendien zijn geactiveerde esters slecht reactief (t1/2 ~5 min), wat kan leiden tot een grote labelingsradius, vooral na verzadiging van naburige eiwitten met biotine 5. In een andere benadering, genetische fusie van gemanipuleerde ascorbaatperoxidase (dwz biotine- fenolradicalen en maakt eiwitlabeling binnen één minuut mogelijk 9. APEX wordt veel gebruikt om subcellulaire proteomen, membraaneiwitcomplexen en cytosolische signaaleiwitcomplexen te identificeren11, 12. De behoefte aan hoge concentraties peroxiden kan echter van invloed zijn op redox-eiwitten of -routes, waardoor cellulaire processen.
Een nieuwe methode die in staat is om meer reactieve gelabelde-radiusonderdrukkingssoorten te genereren met een hoge ruimtelijke en temporele nauwkeurigheid zonder de cellulaire paden significant te verstoren, zal dus een belangrijke aanvulling zijn op bestaande methoden. Onder de reactieve soorten wekte singlet-zuurstof onze aandacht vanwege zijn korte levensduur en beperkte diffusiestraal (t1/2 <0,6 µs in cellen)13. Onder de reactieve soorten wekte singlet-zuurstof onze aandacht vanwege zijn korte levensduur en beperkte diffusiestraal (t1/2 <0,6 µs in cellen)13. еди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниаии и ограниадиуи и ограничадиуи Van de actieve vormen trok singlet-zuurstof onze aandacht vanwege de korte levensduur en beperkte diffusiestraal (t1/2 <0,6 µs in cellen)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13。 1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 еди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченниии и ограниченниого и ограниченниого и ограниченниого и аиенниии и ограниченниого из-за его короткого времени жизни и ограниченниого и ограниченниого и ограниченниого и Van de actieve vormen trekt singlet-zuurstof onze aandacht vanwege zijn korte levensduur en beperkte diffusiestraal (t1/2 <0,6 s in cellen).Van singletzuurstof is gemeld dat het willekeurig methionine, tyrosine, histidine en tryptofaan oxideert, waardoor het polair 14,15 wordt voor hechting aan op amine of thiol gebaseerde sondes16,17.Hoewel singlet-zuurstof is gebruikt om subcellulair compartiment-RNA te labelen, blijven strategieën voor het herbestemmen van endogene POI-nabijheidsmarkers onontgonnen.Hier presenteren we een platform genaamd photoactivation-dependent proximity labeling (PDPL), waar we blauw licht gebruiken om POI's te verlichten die zijn gefuseerd met een miniSOG-fotosensitizer en singlet-zuurstofgeneratie teweeg te brengen om proximale residuen te oxideren, gevolgd door amine-bevattende modificaties om chemische sondes te oxideren in tussenliggende levende cellen..We hebben een groep chemische probes getest om de tagspecificiteit te maximaliseren en modificatiesites geïdentificeerd met behulp van een open proteomics-workflow.Een zij-aan-zij vergelijking van PDPL met TurboID toont een meer specifieke en uitgebreide proteomische dekking van PDPL.We hebben deze benadering toegepast op organel-specifieke markers van het subcellulaire proteoom en algemene proteoomidentificatie van bindingspartners voor het kanker-geassocieerde epigenetische regulerende eiwit BRD4 en het met de ziekte van Parkinson geassocieerde E3-ligase Parkin, wat zowel een bekend als een onbekend netwerk van eiwit bevestigde. interacties..Het vermogen van PDPL om E3-substraten in grote eiwitcomplexen te herkennen, vertegenwoordigt een situatie waarin herkenning van indirecte binders vereist is.Twee onbekende parkinesubstraten gemedieerd door ubiquitinatie-proteasoom zijn in situ bevestigd.
Fotodynamische therapie (PDT)19 en chromofoor-geassisteerde laserinactivatie (CALI)20, waarbij lichtbestraling met fotosensitizers singletzuurstof genereert, doeleiwitten kan inactiveren of celdood kan veroorzaken.Aangezien singletzuurstof een zeer reactieve stof is met een theoretische diffusieafstand van ongeveer 70 nm, kan ruimtelijk beperkte oxidatie rond de fotosensibilisator worden gecontroleerd.Op basis van dit concept hebben we besloten om singlet-zuurstof te gebruiken om een ​​nauwkeurige labeling van eiwitcomplexen in levende cellen te bereiken.We hebben een PDPL-chemoproteomische benadering ontwikkeld om vier functies te vervullen: (1) om de aanmaak van actieve singletzuurstof te katalyseren, vergelijkbaar met de enzymatische PL-benadering;(2) voorzien in tijdsopgeloste labeling bij lichtinitiatie;(3) door wijziging (4) Vermijd het gebruik van endogene cofactoren (zoals biotine) om de achtergrond te verminderen, of gebruik zeer storende exogene reagentia (zoals peroxiden) om blootstelling van cellen aan omgevingsstress te minimaliseren.
Fotosensibilisatoren kunnen worden onderverdeeld in twee categorieën, waaronder fluoroforen met een klein molecuulgewicht (bijv. Bengaalse roos, methyleenblauw)22 en genetisch gecodeerde kleine eiwitten (bijv. miniSOG, KillerRed)23.Om een ​​modulair ontwerp te bereiken, hebben we het PDPL-platform van de eerste generatie ontwikkeld door fotosensitizer (PS) -eiwitten toe te voegen aan POI24,25 (Figuur 1a).Wanneer bestraald met blauw licht, oxideert singlet-zuurstof proximale nucleofiele aminozuurresiduen, wat resulteert in een umpolung-polariteit die elektrofiel is en verder kan reageren met amineprobe-nucleofielen16,17.De sonde is ontworpen met een alkynhandvat om klikchemie en pull-down mogelijk te maken voor LC/MS/MS-karakterisering.
Schematische illustratie van etikettering van eiwitcomplexen gemedieerd door miniSOG.Wanneer ze worden blootgesteld aan blauw licht, genereren cellen die miniSOG-POI tot expressie brengen singlet-zuurstof, die interagerende eiwitten wijzigt, maar niet niet-bindende eiwitten.Tussenproducten van foto-oxidatie worden onderschept door relaislabels van de amine-chemische sonde om covalente adducten te vormen.De alkynylgroep op de chemiesonde maakt klikchemie mogelijk voor verrijking door pull-down gevolgd door LC-MS/MS-kwantificering.b Chemische structuur van amineprobes 1-4.c Representatieve fluorescerende gelanalyse van mitochondriaal gelokaliseerde miniSOG-gemedieerde proteomische markers met behulp van sondes 1-4 en relatieve kwantificering op basis van geldensitometrie.De signaal-tot-achtergrondverhouding van chemische sondes werd beoordeeld met behulp van negatieve controle-experimenten exclusief blauw licht of met HEK293T-cellen zonder miniSOG-expressie.n = 2 biologisch onafhankelijke monsters.Elke stip vertegenwoordigt een biologische replica.d Representatieve detectie en kwantificering van PDPL met behulp van geoptimaliseerde probe 3 in aan- of afwezigheid van de aangegeven PDPL-componenten zoals c.n = 3 biologisch onafhankelijke monsters.Elke stip vertegenwoordigt een biologische replica.Middellijnen en snorharen vertegenwoordigen het gemiddelde en ± standaarddeviatie.CBB: Coomassie Briljant Blauw.e Confocale beeldvorming van singlet-zuurstof met verrode Si-DMA-kleuring.Schaalbalk: 10 µm.Gelbeeldvorming en confocale experimenten werden onafhankelijk ten minste tweemaal herhaald met vergelijkbare resultaten.
We hebben eerst het vermogen getest van de volwassen fotosensitizers miniSOG26 en KillerRed23, stabiel tot expressie gebracht in HEK293T, om propargylamine-labeling van het proteoom als een chemische sonde te mediëren (aanvullende figuur 1a).Gelfluorescentie-analyse toonde aan dat volledige proteoomlabeling werd bereikt met miniSOG en bestraling met blauw licht, terwijl er geen zichtbaar labelingsproduct werd waargenomen met KillerRed.Om de signaal-tot-achtergrondverhouding te verbeteren, hebben we vervolgens een reeks chemische sondes getest die aniline (1 en 3), propylamine (2) of benzylamine (4) bevatten.We hebben waargenomen dat HEK293T-cellen zelf een hoger achtergrondsignaal hadden in vergelijking met geen blauw licht, mogelijk als gevolg van de endogene riboflavine-fotosensitizer, flavine-mononucleotide (FMN)27. Op aniline gebaseerde chemische probes 1 en 3 gaven een betere specificiteit, waarbij HEK293T miniSOG stabiel tot expressie bracht in mitochondriën en een> 8-voudige toename in signaal voor probe 3 vertoonde, terwijl probe 2 die werd gebruikt in de RNA-labelingmethode CAP-seq slechts ~ 2,5- weergeeft voudige signaaltoename, waarschijnlijk als gevolg van verschillende reactiviteitsvoorkeuren tussen RNA en eiwit (Fig. 1b, c). Op aniline gebaseerde chemische probes 1 en 3 gaven een betere specificiteit, waarbij HEK293T miniSOG stabiel tot expressie bracht in mitochondriën en een> 8-voudige toename in signaal voor probe 3 vertoonde, terwijl probe 2 die werd gebruikt in de RNA-labelingmethode CAP-seq slechts ~ 2,5- weergeeft voudige signaaltoename, waarschijnlijk als gevolg van verschillende reactiviteitsvoorkeuren tussen RNA en eiwit (Fig. 1b, c).Op aniline gebaseerde chemische probes 1 en 3 vertoonden een betere specificiteit: HEK293T, dat miniSOG stabiel tot expressie brengt in mitochondriën, vertoont meer dan een 8-voudige toename in signaal voor probe 3, terwijl probe 2, gebruikt in de CAP-seq RNA-labelingmethode, alleen toont ~ 2, 5-voudige signaaltoename, waarschijnlijk als gevolg van verschillende reactiviteitsvoorkeuren tussen RNA en eiwit (Fig. 1b, c).基于苯胺的化学探针1 和3 具有更好的特异性，HEK293T 在线粒体中稳定表达miniSOG，探针3 的信号增加> 8 倍，而用于RNA 标记方法CAP-seq 的探针2 仅显示~ 2,5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 ， hek293t 在 粒体 中 稳定 表达 minisog ， 探针 3 的 信号 增加 增加> 8 倍 而 于 于 rna 标记 cap-eq 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ 2.5 -倍信号增加，可能是由于RNAOp aniline gebaseerde chemische probes 1 en 3 hadden een betere specificiteit, HEK293T bracht miniSOG stabiel tot expressie in mitochondriën, en probe 3 had een meer dan 8-voudige toename in signaal, terwijl probe 2 voor de CAP-seq RNA-labelingmethode slechts ~2,5-voudige toename vertoonde.in het signaal, waarschijnlijk vanwege verschillende reactievoorkeuren tussen RNA en eiwit (Fig. 1b, c).Bovendien werden probe 3-isomeren en hydrazine-probes (probes 5, 6, 7) getest, wat de optimalisatie van probe 3 bevestigde (aanvullende figuur 1b, c).Evenzo onthulde in-gel fluorescentie-analyse andere geoptimaliseerde experimentele parameters: bestralingsgolflengte (460 nm), chemische sondeconcentratie (1 mM) en bestralingstijd (20 min) (aanvullende Fig. 2a-c).Het weglaten van een component of stap in het PDPL-protocol resulteerde in een significante signaalomkering naar de achtergrond (figuur 1d).Met name de eiwitlabeling was significant verminderd in de aanwezigheid van natriumazide of trolox, waarvan bekend is dat ze singletzuurstof blussen.De aanwezigheid van D2O, waarvan bekend is dat het singletzuurstof stabiliseert, versterkt het labelingssignaal.Om de bijdrage van andere reactieve zuurstofsoorten aan labeling te onderzoeken, werden mannitol en vitamine C toegevoegd om respectievelijk hydroxyl- en superoxide-radicaalvangers vast te stellen, 18, 29, maar ze bleken de labeling niet te verminderen.Toevoeging van H2O2, maar geen verlichting, resulteerde niet in labeling (aanvullende figuur 3a).Fluorescentie singlet zuurstofbeeldvorming met Si-DMA-sondes bevestigde de aanwezigheid van singlet-zuurstof in de HEK293T-miniSOG-draad, maar niet in de originele HEK293T-draad.Bovendien kon mitoSOX Red de productie van superoxide niet detecteren na belichting (figuur 1e en aanvullende figuur 3b) 30. Deze gegevens suggereren sterk dat singlet-zuurstof de belangrijkste reactieve zuurstofsoort is die verantwoordelijk is voor daaropvolgende proteomische labeling.De cytotoxiciteit van PDPL werd beoordeeld, inclusief bestraling met blauw licht en chemische sondes, en er werd geen significante cytotoxiciteit waargenomen (aanvullende figuur 4a).
Om het labelingsmechanisme te bestuderen en proteomische identificatie van eiwitcomplexen mogelijk te maken met behulp van LC-MS/MS, moeten we eerst bepalen welke aminozuren zijn gemodificeerd en de delta-massa van probelabels.Van methionine, histidine, tryptofaan en tyrosine is gemeld dat ze worden gemodificeerd door singlet-zuurstof14,15.We integreren de TOP-ABPP31-workflow met de onbevooroordeelde open zoekopdracht van het FragPipe-computerplatform op basis van MSFragger32.Na singlet-zuurstofmodificatie en chemische probe-labeling, werd klikchemie uitgevoerd met behulp van een biotine-reductielabel dat een splitsbare linker bevat, gevolgd door neutravidine-uitrekken en trypsine-digestie.Het gemodificeerde peptide, nog steeds gebonden aan de hars, werd gefotosplitst voor LC-MS/MS-analyse (Figuur 2a en aanvullende gegevens 1).Een groot aantal modificaties vond plaats in het hele proteoom met meer dan 50 peptidekaart (PSM) -overeenkomsten vermeld (Fig. 2b).Verrassend genoeg hebben we alleen modificatie van histidine waargenomen, waarschijnlijk vanwege de hogere reactiviteit van geoxideerd histidine op aniline-probes dan andere aminozuren.Volgens het gepubliceerde mechanisme van histidine-oxidatie door singlet-zuurstof21,33 komt de voorgestelde delta-massastructuur van +229 Da overeen met het adduct van probe 3 met 2-oxo-histidine na twee oxidaties, terwijl +247 Da het hydrolyseproduct is van +229 Da (aanvullende figuur 5).De evaluatie van het MS2-spectrum toonde een hoge betrouwbaarheid van identificatie van de meeste y- en b-ionen, inclusief de identificatie van gemodificeerde fragmentionen (y en b) (Fig. 2c).Contextanalyse van de lokale sequentie van PDPL-gemodificeerde histidinen onthulde een matige motiefvoorkeur voor kleine hydrofobe residuen op ± 1-posities (aanvullende figuur 4b).Gemiddeld werden 1, 4 histidinen per eiwit geïdentificeerd en de plaatsen van deze markers werden bepaald door analyse van het toegankelijke oppervlak van het oplosmiddel (SASA) en relatieve beschikbaarheid van oplosmiddel (RSA) (aanvullende figuur 4c, d).
Een onbevooroordeelde workflow voor het bestuderen van resterende selectiviteit met behulp van het FragPipe-computerplatform, mogelijk gemaakt door MSFragger.Splitsbare linkers worden gebruikt in de Click-chemie om fotosplitsing van gemodificeerde peptiden uit streptavidinehars mogelijk te maken.Er werd een open zoektocht gelanceerd om tal van wijzigingen en relevante restanten te identificeren.b Wijs de hoeveelheid modificaties toe die in het hele proteoom voorkomen.Peptide mapping PSM.c Spectrale annotatie van MS2 van histidineplaatsen gemodificeerd met probe 3. Als representatief voorbeeld voegde een covalente reactie met probe 3 +229,0938 Da toe aan het gemodificeerde aminozuur.d Mutatietest gebruikt om te testen op PDPL-markers.PRDX3 (H155A, H225A) en PRDX1 (H10A, H81A, H169A) werden getransfecteerd met wildtype plasmiden voor anti-Flag-detectie.e Het synthetische peptide werd gereageerd met gezuiverd miniSOG in aanwezigheid van probe 3 en de overeenkomstige producten met Δm +247 en +229 werden opgemerkt in het LC-MS-spectrum.f In vitro eiwit-tot-eiwit interacties gemodelleerd met miniSOG-6xHis-tag en anti-6xHis antilichaam.Antibiotine (streptavidine-HRP) en anti-muis Western-blot-analyse van miniSOG-6xHis/anti-6xHis-antilichaamcomplexen gelabeld met probe 3, afhankelijk van de tijd van blootstelling aan licht.Labels voor individuele eiwitten worden uitgedrukt in het overeenkomstige molecuulgewicht: LC-antilichaam lichte keten, HC-antilichaam zware keten.Deze experimenten werden onafhankelijk ten minste tweemaal herhaald met vergelijkbare resultaten.
Voor biochemische verificatie van de labelingsplaats werden PRDX3 en PRDX1 geïdentificeerd door massaspectrometrie veranderd van histidine in alanine en vergeleken met wildtype in transfectie-assays.De PDPL-resultaten toonden aan dat de mutatie de labeling aanzienlijk verminderde (figuur 2d).Ondertussen werden de peptidesequenties geïdentificeerd in de open zoektocht gesynthetiseerd en in vitro gereageerd met gezuiverd miniSOG in aanwezigheid van probe 3 en blauw licht, wat producten opleverde met een massaverschuiving van +247 en +229 Da wanneer gedetecteerd door LC-MS (Fig. 2e).).Om te testen of interagerende proximale eiwitten in vitro kunnen worden gelabeld als reactie op miniSOG-fotoactivatie, hebben we een kunstmatige nabijheidstest ontworpen door interactie tussen het miniSOG-6xHis-eiwit en een anti-His monoklonaal antilichaam in vitro (Figuur 2f).In deze test verwachtten we proximale labeling van zware en lichte ketens van antilichamen met miniSOG.In feite vertoonden anti-muis (die de zware en lichte ketens van anti-6xHis-gelabeld antilichaam herkent) en streptavidine Western-blots een sterke biotinylering van de zware en lichte ketens.We merkten met name miniSOG-autobiotinylatie op vanwege de 6xHis-tag en cross-links tussen lichte en zware ketens, wat mogelijk verband houdt met de eerder beschreven kloof tussen lysine en 2-oxo-histidine proximale respons.Concluderend concluderen we dat PDPL histidine modificeert op een nabijheidsafhankelijke manier.
Ons volgende doel was om het subcellulaire proteoom te karakteriseren om de specificiteit van in situ labeling te testen.Daarom brachten we miniSOG stabiel tot expressie in de kern, mitochondriale matrix of buitenste ER-membraan van HEK293T-cellen (Fig. 3a).Gelfluorescentieanalyse onthulde overvloedige gelabelde banden op drie subcellulaire locaties evenals verschillende labelpatronen (figuur 3b).Fluorescentiebeeldvormingsanalyse toonde een hoge specificiteit van PDPL (figuur 3c).De PDPL-workflow werd gevolgd door klikreacties met rhodamine-kleurstoffen om subcellulaire proteomen af ​​​​te bakenen met behulp van fluorescentiemicroscopie, en PDPL-signalen werden gecolokaliseerd met DAPI, mitochondriale trackers of ER-trackers, wat de hoge betrouwbaarheid van PDPL bevestigt.Voor de drie organellocaties toonde een zij-aan-zij vergelijking van PDPL met TurboID met behulp van avidine western blot aan dat PDPL specifieker was gelabeld in vergelijking met hun respectieve controles.Onder PDPL-omstandigheden verschenen meer gelabelde banden, wat wijst op meer PDPL-gelabelde eiwitten (aanvullende figuur 6a-d).
een schematische weergave van miniSOG-gemedieerde organel-specifieke proteoomlabeling.miniSOG richt zich op de mitochondriale matrix via fusie naar de N-terminale 23 aminozuren van menselijk COX4 (mito-miniSOG), de kern via fusie naar H2B (nucleus-miniSOG) en Sec61β via de cytoplasmatische kant van het ER-membraan (ER-miniSOG ).Indicaties zijn onder meer gelbeeldvorming, confocale beeldvorming en massaspectrometrie.b Representatieve gelafbeeldingen van drie organel-specifieke PDPL-profielen.CBB Coomassie Briljant Blauw.c Representatieve confocale beelden van HEK293T-cellen die miniSOG stabiel tot expressie brengen met verschillende subcellulaire lokalisaties gedetecteerd door antilichaam met het label V5 (rood).Subcellulaire markers worden gebruikt voor mitochondriën en ER (groen).De PDPL-workflow omvat de detectie van miniSOG (geel) gelabelde subcellulaire proteomen met behulp van Cy3-azide klikchemie.Schaalbalk: 10 µm.d Vulkanische plots van PDPL-gelabelde proteomen in verschillende organellen gekwantificeerd door niet-gelabelde kwantificering (n = 3 onafhankelijke biologische experimenten).Tweezijdige Student's t-test werd gebruikt op vulkaanplots.HEK293T wildtype werd gebruikt als een negatieve controle. Aanzienlijk veranderde eiwitten zijn rood gemarkeerd (p <0,05 en> 2-voudig ionenintensiteitsverschil). Aanzienlijk veranderde eiwitten zijn rood gemarkeerd (p <0,05 en> 2-voudig ionenintensiteitsverschil). ачительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). Aanzienlijk veranderde eiwitten zijn rood gemarkeerd (p <0,05 en> 2-voudig verschil in ionenintensiteit).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 ачительно измененные белки выделены красным етом (p < 0,05 и > 2-кратная азница в ионной силе). Aanzienlijk veranderde eiwitten zijn rood gemarkeerd (p <0,05 en> 2-voudig verschil in ionsterkte).Verwante eiwitten die belangrijk zijn voor HEK293T-miniSOG maar niet belangrijk voor HEK293T worden in groen weergegeven.e Analyse van de specificiteit van proteomische datasets uit experimenten d.Het totale aantal statistisch significante eiwitten in elk organel (rode en groene stippen) is bovenaan gemarkeerd.Histogrammen tonen eiwitten gelokaliseerd in organellen op basis van MitoCarta 3.0, GO-analyse en A. Ting et al.mensen.Aparte datasets voor mitochondriën, kernen en ER.Deze experimenten werden onafhankelijk ten minste tweemaal herhaald met vergelijkbare resultaten.Ruwe gegevens worden geleverd in de vorm van onbewerkte gegevensbestanden.
Aangemoedigd door de gel- en beeldvormingsresultaten, werd labelvrije kwantificering gebruikt om het geïdentificeerde proteoom in elk organel te kwantificeren (aanvullende gegevens 2).Niet-getransfecteerde HEK293T werd gebruikt als een negatieve controle om achtergrondmarkers af te trekken. Vulkaanplotanalyse toonde significant verrijkte eiwitten (p <0, 05 en> 2-voudige ionenintensiteit) evenals singleton-eiwitten die alleen aanwezig zijn in lijnen die miniSOG tot expressie brengen (Fig. 3d rode en groene stippen). Vulkaanplotanalyse toonde significant verrijkte eiwitten (p <0, 05 en> 2-voudige ionenintensiteit) evenals singleton-eiwitten die alleen aanwezig zijn in lijnen die miniSOG tot expressie brengen (Fig. 3d rode en groene stippen). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). Vulkaanplotanalyse toonde significant verrijkte eiwitten (p <0,05 en> 2-voudige ionenintensiteit) evenals enkele eiwitten die alleen aanwezig zijn in lijnen die miniSOG tot expressie brengen (Fig. 3d, rode en groene stippen).火山图分析显示出显着富集的蛋白质（p < 0,05 和>2 倍离子强度）以及仅存在于miniSOG 表达系中的单一蛋白质（图3d 红色和绿色点）。火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 （p <0,05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 存 在于 在于 minisog 表达 系 的 单一 蛋白质 （图 3d 红色 绿色点。。。）））））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Vulkaanplotanalyse onthulde significant verrijkte eiwitten (p <0,05 en> 2x ionsterkte) evenals enkele eiwitten die alleen aanwezig zijn in de miniSOG-expressielijn (rode en groene stippen in Fig. 3d).Door deze gegevens te combineren, identificeerden we respectievelijk 1364, 461 en 911 statistisch significante nucleaire, mitochondriale en ER-buitenmembraaneiwitten.Om de nauwkeurigheid van organel-gelokaliseerde PDPL te analyseren, gebruikten we MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO) -analyse en A. Ting et al.een dataset8 werd gebruikt voor mitochondriën, kern en ER om de organelspecificiteit van de gedetecteerde eiwitten te testen, wat overeenkomt met een nauwkeurigheid van 73,4, 78,5 en 73,0% (figuur 3e).De specificiteit van PDPL bevestigt dat PDPL een ideaal hulpmiddel is voor het identificeren van organel-specifieke proteomen.Met name toonde de indieningochondriale analyse van geïdentificeerde mitochondriale eiwitten aan dat het gevangen proteoom voornamelijk werd verdeeld in de matrix en het binnenmembraan (respectievelijk 226 en 106), goed voor 91,7% (362) van het totale aantal geïdentificeerde mitochondriale eiwitten.een hoog niveau van PDPL werd bovendien bevestigd (aanvullende figuur 7a).Evenzo toonde subnucleaire analyse aan dat het gevangen proteoom voornamelijk werd verdeeld in de kern, nucleoplasma en nucleolus (aanvullende figuur 7b).Nucleaire proteomische analyse met een nucleair lokalisatiesignaalpeptide (3xNLS) vertoonde een vergelijkbare nauwkeurigheid als het H2B-construct (aanvullende figuur 7c-h).Om de specificiteit van de PDPL-marker te bepalen, werd nucleair laminine A gekozen als een meer discrete gelokaliseerde POI7-val.PDPL identificeerde 36 significant verrijkte eiwitten, waarvan 12 eiwitten (30,0% inclusief lamin A) goed gekarakteriseerde lamin A-interagerende eiwitten waren, geannoteerd door de String-database, met een hoger percentage dan de BioID-methode (122 eiwitten) 28 van 28. , 22,9 %) 7. Onze methode identificeerde minder eiwitten, mogelijk als gevolg van beperkte labelingsgebieden, wat mogelijk werd gemaakt door actievere singlet-zuurstof.GO-analyse toonde aan dat de geïdentificeerde eiwitten voornamelijk gelokaliseerd waren in het nucleoplasma (26), kernmembraan (10), kernmembraan (9) en kernporiën (5).Gezamenlijk waren deze nucleair gelokaliseerde eiwitten goed voor 80% van de verrijkte eiwitten, wat de specificiteit van PDPL verder aantoont (aanvullende figuren 8a-d).
Nadat we het vermogen van PDPL hadden vastgesteld om nabijheidsmarkering in organellen uit te voeren, hebben we vervolgens getest of PDPL kon worden gebruikt om POI-bindingspartners te analyseren.In het bijzonder hebben we geprobeerd PDPL-analyse van cytosolische eiwitten te definiëren, die vanwege hun zeer dynamische aard als moeilijkere doelen worden beschouwd dan hun membraan-gelokaliseerde tegenhangers.Het bromodomein en extraterminaal (BET) eiwit BRD4 heeft onze aandacht getrokken vanwege zijn sleutelrol bij verschillende ziekten 35, 36 .Het door BRD4 gevormde complex is een transcriptionele co-activator en een belangrijk therapeutisch doelwit.Door de expressie van c-myc- en Wnt5a-transcriptiefactoren te reguleren, wordt aangenomen dat BRD4 een belangrijke determinant is van acute myeloïde leukemie (AML), multipel myeloom, Burkitt-lymfoom, colonkanker en ontstekingsziekten37,38.Bovendien richten sommige virussen zich op BRD4 om virale en cellulaire transcriptie te reguleren, zoals papillomavirus, HIV en SARS-CoV-236,39.
Om de BRD4-interactie in kaart te brengen met behulp van PDPL, hebben we miniSOG gecombineerd met een korte N- of C-terminale isovorm van BRD4.Proteomische resultaten onthulden een hoge mate van overlap tussen de twee constructen (aanvullende figuur 9a).Het nucleaire proteoom geïdentificeerd met miniSOG-H2B omvat 77,6% van de eiwitten die een interactie aangaan met BRD4 (aanvullende figuur 9b).Vervolgens werden verschillende belichtingstijden (2, 5, 10, 20 min) gebruikt om de markeringsstraal aan te passen (Fig. 4a en aanvullende gegevens 3).We concluderen dat PDPL bij kortere fotoperioden voornamelijk directe bindingspartners zal labelen, terwijl langere perioden eiwitten zullen omvatten die zijn geïdentificeerd tijdens kortere fotoactivatieperioden, evenals indirecte doelen in labelcomplexen.In feite vonden we een sterke overlap tussen aangrenzende tijdspunten (84,6% gedurende 2 en 5 minuten; 87,7% gedurende 5 en 10 minuten; 98,7% gedurende 10 en 20 minuten) (Fig. 4b en Aanvullende Fig. 9c).In alle experimentele groepen vonden we niet alleen BRD4-zelflabeling, maar ook verschillende bekende doelen zoals MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A en HMGB1 geannoteerd in de string-database.De ionsterkte van deze doelen is evenredig met de blootstellingstijd (figuur 4c en aanvullende figuur 9d).GO-analyse van de eiwitten die in de groep van 2 minuten werden geïdentificeerd, toonde aan dat de geïdentificeerde eiwitten in de kern waren gelokaliseerd en betrokken waren bij de hermodellering van chromatine en de functie van RNA-polymerase.De moleculaire functie van het eiwit was verrijkt in chromatinebinding of transcriptionele co-activering, consistent met de BRD4-functie (figuur 4d).String-database-enabled eiwitinteractieanalyse onthulde een eerste niveau van indirecte interacties tussen BRD4- en HDAC-familie-interagerende complexen zoals SIN3A, NCOR2, BCOR en SAP130 (Fig. 4e en Aanvullende Fig. 9e), consistent met BRD4- en HDAC-bindende geacetyleerde histonen ..Bovendien werden representatieve doelen geïdentificeerd door LC-MS / MS, waaronder Sin3A, NSUN2, Fus en SFPQ, bevestigd door Western-blotting (figuur 4f).Onlangs is gemeld dat de korte isovorm van BRD4 kernen vormt met vloeistof-vloeistoffasescheiding (LLPS) eigenschappen.De RNA-bindende eiwitten Fus en SFPQ bemiddelen de LLPS van verschillende cellulaire processen en zijn hier geïdentificeerd als niet-geregistreerde BRD4-bindende eiwitten.De interactie tussen BRD4 en SFPQ werd bevestigd door co-immunoprecipitatie (co-IP) experimenten (Figuur 4g), wat suggereert dat een ander mechanisme voor BRD4-gemedieerde vloeistof-vloeistoffasescheiding nader onderzoek verdient.Samengevat suggereren deze resultaten dat PDPL een ideaal platform is voor het identificeren van bekende BRD4-interagerende en onbekende bindende eiwitten.
een schematische weergave van miniSOG-gemedieerde BRD4-nabijheidsmarkering, belichtingstijden: 2, 5, 10 en 20 min.b Overlap van eiwitten geïdentificeerd op verschillende belichtingstijden.Eiwitverrijking geïdentificeerd in HEK293T-miniSOG-BRD4 was statistisch significant in vergelijking met wildtype HEK293T.c Ionenintensiteit bij het kwantificeren van niet-gelabelde representatieve bekende BRD4-bindende eiwitten tijdens de gespecificeerde blootstellingstijd.n = 3 biologisch onafhankelijke monsters.Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie.d Genontologische analyse (GO) van eiwitten geïdentificeerd in de groep van 2 minuten.De eerste tien GO-termen staan ​​vermeld.Bubbels zijn gekleurd volgens de GO-termcategorie en de belgrootte is evenredig met het aantal eiwitten dat in elke term wordt gevonden.e Stringanalyse van eiwitten die interageren met BRD4.De gele cirkels zijn directe lijm en de grijze cirkels zijn de eerste laag indirecte lijm.De rode lijnen vertegenwoordigen de experimenteel bepaalde interacties en de blauwe lijnen vertegenwoordigen de voorspelde interacties.f Representatieve BRD4-bindingsdoelen geïdentificeerd in LC-MS / MS werden geverifieerd door Western-blotting.g Co-immunoprecipitatie-experimenten bevestigen de interactie tussen SFPQ en BRD4.Deze experimenten werden onafhankelijk ten minste tweemaal herhaald met vergelijkbare resultaten.Ruwe gegevens worden geleverd in de vorm van onbewerkte gegevensbestanden.
Naast het identificeren van niet-geregistreerde POI-geassocieerde doelen, veronderstellen we dat PDPL geschikt zal zijn voor het identificeren van substraten voor enzymen, waarvoor de karakterisering van indirect bindende eiwitten in grote complexen nodig is om niet-geregistreerde substraten te annoteren.Parkine (gecodeerd door PARK2) is een E3-ligase en het is bekend dat mutaties in parkine de autosomaal recessieve juveniele ziekte van Parkinson (AR-JP) veroorzaken42.Bovendien is parkine beschreven als essentieel voor mitofagie (mitochondriale autofagie) en verwijdering van reactieve zuurstofsoorten.Hoewel er verschillende parkinesubstraten zijn geïdentificeerd, blijft de rol van parkine bij deze ziekte onduidelijk.Om de niet-gekarakteriseerde substraten te annoteren, werd PDPL getest door miniSOG toe te voegen aan de N- of C-terminus van parkine.Cellen werden behandeld met de carbonylcyanide-protontransporter m-chloorfenylhydrazon (CCCP) om parkine te activeren via de PINK1-Parkin-route.Vergeleken met onze BRD4 PDPL-resultaten onthulde parkine N-terminusfusie een grotere set doeleiwitten, hoewel het een groter deel van de C-terminus bedekte (177 van de 210) (Figuur 5a, b en aanvullende gegevens 4).het resultaat komt overeen met rapporten dat N-terminale tags Parkin op afwijkende wijze kunnen activeren44.Verrassend genoeg waren er slechts 18 overlappende eiwitten in onze gegevens met gepubliceerde AP-MS-resultaten voor Parkin43, waarschijnlijk als gevolg van verschillen tussen cellijnen en proteomics-workflows.Naast vier bekende eiwitten (ARDM1, HSPA8, PSMD14 en PSMC3) geïdentificeerd door twee methoden (Fig. 5c)43.Om de resultaten van LC-MS/MS verder te valideren, werden PDPL-behandeling en daaropvolgende Western-blotting gebruikt om de resultaten van de HEK293T-ouderceltest en de stabiele N-terminale parkin-lijn te vergelijken.Eerder onbekende doelen CDK2, DUT, CTBP1 en PSMC4 werden getest met een bekend bindmiddel, DNAJB1 (Fig. 5d).
Vulkaanplot van parkine-interagerende eiwitten in HEK293T-cellen met stabiel tot expressie gebracht miniSOG gefuseerd aan de N- of C-terminus van parkine (n = 3 onafhankelijke biologische experimenten).Tweezijdige Student's t-test werd gebruikt op vulkaanplots.HEK293T werd gebruikt als een negatieve controle. Aanzienlijk veranderde eiwitten zijn rood gemarkeerd (p <0,05 en> 2-voudig ionenintensiteitsverschil). Aanzienlijk veranderde eiwitten zijn rood gemarkeerd (p <0,05 en> 2-voudig ionenintensiteitsverschil). ачительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). Aanzienlijk veranderde eiwitten zijn rood gemarkeerd (p <0,05 en> 2-voudig verschil in ionenintensiteit).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 ачительно измененные белки выделены красным етом (p < 0,05 и > 2-кратная азница в ионной силе). Aanzienlijk veranderde eiwitten zijn rood gemarkeerd (p <0,05 en> 2-voudig verschil in ionsterkte).Verwante eiwitten die belangrijk zijn voor HEK293T-miniSOG maar niet belangrijk voor HEK293T worden in groen weergegeven.b Venn-diagram dat overlappende eiwitten toont tussen N-terminale en C-terminale constructen.N-terminale tags kunnen op afwijkende wijze parkine activeren en resulteren in meer herkenbare eiwitten.c Venn-diagram met overlappende eiwitten tussen PDPL en AP-MS.Bekende interactoren worden vermeld, waaronder 4 van 18 overlappende eiwitten en 11 van 159 eiwitten die specifiek zijn geïdentificeerd in PDPL.d Representatieve doelen geïdentificeerd door LC-MS / MS werden geverifieerd door Western-blotting.e Ssu72 en SNW1 werden geïdentificeerd als niet-geregistreerde parkin-substraten.Deze FLAG-gelabelde eiwitplasmiden werden getransfecteerd in HEK293T en HEK293T-Parkin-miniSOG gevolgd door CCCP-behandeling op verschillende tijdstippen.De degradatie was meer uitgesproken in de Parkin-overexpressielijn.f Met behulp van de proteasoomremmer MG132 werd bevestigd dat het afbraakproces van Ssu72 en SNW1 wordt gemedieerd door proteasoom-ubiquitinatie.Deze experimenten werden onafhankelijk ten minste tweemaal herhaald met vergelijkbare resultaten.Ruwe gegevens worden geleverd in de vorm van onbewerkte gegevensbestanden.
Met name moeten de door PDPL geïdentificeerde eiwitten parkine-bindende eiwitten en hun substraten bevatten.Om ongeregistreerde parkinesubstraten te detecteren, selecteerden we zeven geïdentificeerde eiwitten (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 en SNW1) en getransfecteerde plasmiden om deze genen bloot te stellen aan normale HEK293T en miniSOG-Parkin's HEK293T stabiel tot expressie te brengen, gevolgd door CCCP-behandeling.De niveaus van Ssu72- en SNW1-eiwitten waren significant verlaagd in de stabiele miniSOG-Parkin-lijn (figuur 5e).Behandeling met CCCP gedurende 12 uur resulteerde in de meest significante afbraak van beide substraten.Om te onderzoeken of de afbraak van Ssu72 en SNW1 wordt gereguleerd door proteasoom-ubiquitinatie, werd de proteasoomremmer MG132 toegevoegd om de proteasoomactiviteit te remmen, en in feite ontdekten we dat hun afbraakproces werd geremd (Fig. 5f).Aanvullende niet-substraatdoelen werden bevestigd als Parkin-interactors met behulp van Western-blotting (aanvullende figuur 10), die consistente resultaten vertoonde met LC-MS / MS.Concluderend maakt de integratie van de PDPL-workflow met doeleiwittransfectieverificatie de identificatie van niet-geregistreerde E3-ligasesubstraten mogelijk.
We hebben een algemeen platform voor nabijheidsmarkering ontwikkeld waarmee u POI's in ruimte en tijd kunt identificeren.Het platform is gebaseerd op het miniSOG-fotosensitizer-eiwit, dat slechts ongeveer 12 kDa is, minder dan de helft van het volwassen APEX2-enzym (27 kDa) en een derde van de grootte van TurboID (35 kDa).De kleinere omvang zou het scala aan toepassingen voor het bestuderen van kleine eiwit-interactomen aanzienlijk moeten uitbreiden.Verdere verkenning van aanvullende fotosensitizers, of het nu genetisch gecodeerde eiwitten of kleine moleculen zijn, is nodig om de kwantumopbrengst van singlet-zuurstof te verhogen en de gevoeligheid van deze benadering uit te breiden.Voor de huidige versie van miniSOG kan een hoge temporele resolutie worden bereikt door blauwe verlichting te gebruiken om nabijheidsmarkeringen te activeren.Bovendien gaf een langere belichtingstijd een grotere "wolk" singletzuurstof vrij, wat resulteerde in modificatie van meer distale histidine-residuen, een grotere labelradius en het vermogen om de ruimtelijke resolutie van de PDPL te verfijnen.We hebben ook zeven chemische sondes getest om de signaal-tot-achtergrondverhouding te vergroten en het moleculaire mechanisme achter deze benadering onderzocht.De TOP-ABPP-workflow in combinatie met onbevooroordeeld open zoeken bevestigde dat wijzigingen alleen in histidines voorkwamen en dat er geen consistente micro-omgeving werd waargenomen voor verhoogde histidine-modificaties, behalve een matige voorkeur voor histidines in het lusgebied.
PDPL is ook gebruikt om subcellulaire proteomen te karakteriseren met proteoomspecificiteit en dekking die op zijn minst vergelijkbaar is met andere proximity-labeling en organel-specifieke chemische sondemethoden.Nabijheidsmarkers zijn ook met succes gebruikt om de oppervlakte-, lysosomale en secretoom-geassocieerde proteomen te karakteriseren46,47.Wij geloven dat PDPL compatibel zal zijn met deze subcellulaire organellen.Daarnaast hebben we PDPL uitgedaagd door doelen voor cytosolische eiwitbinding te identificeren die complexer zijn dan membraangebonden eiwitten vanwege hun dynamische eigenschappen en betrokkenheid bij meer tijdelijke interacties.PDPL werd toegepast op twee eiwitten, de transcriptionele co-activator BRD4 en de ziekte-geassocieerde ligase E3 Parkin.Deze twee eiwitten werden niet alleen gekozen vanwege hun fundamentele biologische functies, maar ook vanwege hun klinische relevantie en therapeutisch potentieel.Voor deze twee POI's werden zowel bekende bindingspartners als niet-geregistreerde doelen geïdentificeerd.Met name het met fasescheiding geassocieerde eiwit SFPQ werd bevestigd door co-IP, wat kan wijzen op een nieuw mechanisme waarmee BRD4 (korte isovorm) LLPS reguleert.Tegelijkertijd zijn we van mening dat de identificatie van Parkin-substraten een scenario is waarin de identificatie van indirecte lijmen vereist is.We identificeerden twee niet-geïdentificeerde parkinesubstraten en bevestigden hun afbraak langs de ubiquitinerings-proteasoomroute.Onlangs is een op mechanismen gebaseerde vangstrategie ontwikkeld om hydrolase-substraten te detecteren door ze met enzymen te vangen.Hoewel dit een zeer krachtige methode is, is deze niet geschikt voor de analyse van substraten die betrokken zijn bij de vorming van grote complexen en vereist de vorming van covalente bindingen tussen het enzym en het substraat.We verwachten dat PDPL kan worden uitgebreid om andere eiwitcomplexen en enzymfamilies te bestuderen, zoals de deubiquitinase- en metalloproteasefamilies.
Er is een nieuwe vorm van miniSOG, SOPP3 genaamd, ontwikkeld met verbeterde singlet-zuurstofproductie.We vergeleken miniSOG met SOPP3 en vonden verbeterde markeringsprestaties, hoewel de signaal-ruisverhouding ongewijzigd bleef (aanvullende figuur 11).We veronderstelden dat optimalisatie van SOPP3 (bijvoorbeeld door gerichte evolutie) zou leiden tot efficiëntere fotosensitizer-eiwitten die kortere lichttijden nodig hebben en dus meer dynamische cellulaire processen kunnen vastleggen.Met name is de huidige versie van PDPL beperkt tot de cellulaire omgeving, omdat deze verlichting met blauw licht vereist en niet in diepe weefsels kan doordringen.Deze functie sluit het gebruik ervan in diermodelstudies uit.De combinatie van optogenetica met PDPL zou echter een kans kunnen bieden voor dieronderzoek, vooral in de hersenen.Bovendien verwijderen andere gemanipuleerde infrarood fotosensitizers deze beperking ook.Op dit gebied wordt momenteel onderzoek gedaan.
De HEK293T-cellijn werd verkregen van ATCC (CRL-3216).De cellijn testte negatief op mycoplasma-infectie en werd gekweekt in DMEM (Thermo, #C11995500BT) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS, Vistech, #SE100-B) en 1% penicilline/streptomycine (Hyclone, #SV30010).gegroeid in.
3-Aminofenyleen (monster 3) en (4-ethynylfenyl)methaanamine (monster 4) werden gekocht bij Bidepharm.Propylamine (probe 2) werd gekocht bij Energy-chemicals.N-(2-Aminofenyl)pent-4-ynamide (probe 1) werd gesynthetiseerd volgens gepubliceerde methoden.
Aanvullende tabel 1 geeft een overzicht van de genetische constructies die in deze studie zijn gebruikt.De miniSOG- en KillerRed-sequenties werden gekloond uit een geschenkplasmide van P. Zou (Peking University).De mitochondriale matrix-targeting-sequentie werd afgeleid van de 23 N-terminale aminozuren van COX4 en gekloneerd in de aangegeven vectoren met behulp van een Gibson-assemblage (Beyotime, #D7010S).Om het membraan en de kern van het endoplasmatisch reticulum te targeten, werd SEC61B humaan DNA (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) geamplificeerd door PCR uit een cDNA-bibliotheek van HEK293T-cellen en H2B-DNA (gedoneerd door D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) en gekloond, zoals hierboven vermeld.Tenzij anders aangegeven, werden andere eiwitgenen die werden gebruikt voor transfectie en constructie van stabiele cellijnen PCR-geamplificeerd uit de HEK293T-cel-cDNA-bibliotheek.G3S (GGGS) en G4S (GGGGS) werden gebruikt als linkers tussen het lokaas-eiwit en miniSOG.Aan deze fusieconstructen werd een V5-epitooplabel (GKPINPLLGLDST) toegevoegd.Voor expressie in zoogdieren en om een ​​stabiele cellijn tot stand te brengen, werd het miniSOG-fusieconstruct gesubkloneerd in de pLX304-lentivirale vector.Voor bacteriële expressie werd miniSOG gekloneerd in de pET21a-vector met het label 6xHis aan het C-uiteinde.
HEK293T-cellen werden uitgezaaid met 2,0 x 105 cellen per putje in platen met zes putjes en 24 uur later getransfecteerd met recombinante lentivirale plasmiden (2,4 g pLX304) en virale verpakkingsplasmiden (1,5 g psPAX2 en 1,2 μg pMD2.G) met behulp van Lipo8000 (Beyotime , #C0533), ongeveer 80% fusie.Na transfectie gedurende de nacht werd het medium verwisseld en nog eens 24 uur geïncubeerd.De verzameling van het virus vond plaats na 24, 48 en 72 uur.Voorafgaand aan infectie van de doelcellijnen werd het virale medium gefiltreerd door een 0,8 m filter (Merck, #millex-GP) en werd polybreen (Solarbio, #H8761) toegevoegd tot een concentratie van 8 μg/ml.Na 24 uur mochten de cellen herstellen door het medium te verwisselen.Cellen werden geselecteerd met 5 μg/ml blasticidine (Solarbio, #3513-03-9) voor de eerste drie passages als een lagere stringente selectie.Gebruik vervolgens 20 g/ml als een strenger regime voor de volgende drie passages.
Cellen werden gezaaid in kamers met 12 putjes (Ibidi, #81201) met een dichtheid van ongeveer 20.000 cellen per putje.Om de adhesie van HEK293T-cellen te verbeteren, voegt u 50 µg/ml fibronectine (Corning, #356008) toe, verdund in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, Sangon, #B640435) bij 37°C.De kamers werden 1 uur voorbehandeld en vervolgens verwijderd met PBS.Na 24 uur werden de cellen eenmaal gewassen met PBS, geïncubeerd met 1 mM probe 3 in verse Hanks' gebalanceerde zoutoplossing (HBSS, Gibco, #14025092) gedurende 1 uur bij 37°C, en vervolgens geïncubeerd met een blauwe LED (460 nm ).) werden gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur bestraald.Daarna werden de cellen tweemaal gewassen met PBS en gefixeerd met 4% formaldehyde in PBS (Sangon, #E672002) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.Overmaat formaldehyde werd verwijderd uit gefixeerde cellen door driemaal te wassen met PBS.Cellen werden vervolgens gepermeabiliseerd met 0,5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) in PBS en 3 keer gewassen met PBS.Verwijder vervolgens de kamer en voeg aan elk monster 25 µl van een klikreactiemengsel toe dat 50 µM Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) bevat. en 0,5 mg/ml natriumascorbaat (Aladdin, nr. S105024) en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd.Na een snelle reactie werden de cellen zes keer gewassen met PBS met 0,05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) en vervolgens geblokkeerd met 5% BSA (Abcone, #B24726) in PBST gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
Voor colocalisatie-immunokleuring werden cellen geïncubeerd met primaire antilichamen volgens de aangegeven omstandigheden: muis-anti-V5-tag-mAb (1:500, CST, #80076), konijn-anti-Hsp60-mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), konijn polyklonaal anti-calnexine antilichaam (1:500, Abcam, #ab22595) of konijn anti-lamin A/C monoklonaal antilichaam (1:500; CST, #2032) bij 4 ° C 's nachts.Na 3 keer wassen met PBST werden cellen geïncubeerd met secundaire antilichamen: geit-anti-konijn Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) 1:1000 verdund, geit-anti-muis Alexa Fluor 594 (CST, #8889) 1:1000 verdund.verdunning Verdun bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.Cellen werden vervolgens 3 keer gewassen met PBST en tegengekleurd met DAPI (Thermo, #D1306) in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.Na 3 wassingen met PBS werden de cellen afgesloten in 50% glycerol (Sangon, #A600232) in PBS voor beeldvorming.Immunofluorescentiebeelden werden verkregen met behulp van een ZEISS LSM 900 Airyscan2 confocale microscoop en ZNE 3.5-software.
Voor singlet zuurstoffluorescentiebeeldvorming werden cellen tweemaal gewassen met Hanks HEPES-buffer voordat 100 nM Si-DMA werd toegevoegd in Hanks HEPES-buffer (DOJINDO, #MT05).Na blootstelling aan licht werden de cellen gedurende 45 minuten bij 37°C in een C02-incubator geïncubeerd.De cellen werden vervolgens tweemaal gewassen met Hanks' HEPES-buffer en tegengekleurd met Hoechst in Hanks' HEPES-buffer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en zichtbaar gemaakt met behulp van een ZEISS LSM 900 confocale microscoop., #M36008) in HBSS-buffer die calcium en magnesium bevat.Na blootstelling aan licht of doxorubicine (MCE, #HY-15142A) werden de cellen gedurende 10 minuten bij 37°C in een C02-incubator geïncubeerd, tweemaal met HBSS-buffer gewassen en bij kamertemperatuur met Hoechst in HBSS-buffer geïncubeerd.minuten.Doxorubicine werd gebruikt als een positieve probecontrole waarbij cellen gedurende 30 minuten werden behandeld met 20 M doxorubicine in HBSS met 1% BSA.Immunofluorescentiebeelden werden verkregen met behulp van een Zeiss LSM 900 confocale microscoop.
HEK293T-cellen die mito-miniSOG stabiel tot expressie brengen, werden gezaaid met een dichtheid van ongeveer 30% in schalen van 15 cm.Na 48 uur, toen ~80% confluentie was bereikt, werden de cellen eenmaal gewassen met PBS, geïncubeerd met 1 mM Probe 3 in verse HBSS-buffer gedurende 1 uur bij 37°C en vervolgens belicht met een blauwe LED gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur temperatuur..Daarna werden de cellen tweemaal gewassen met PBS, afgeschraapt en opnieuw gesuspendeerd in ijskoude PBS-buffer die EDTA-vrije proteaseremmers bevatte (MCE, #HY-K0011).Cellen werden gelyseerd door de punt gedurende 1 minuut te soniceren (1 seconde aan en 1 seconde uit met een amplitude van 35%).Het resulterende mengsel werd 10 min bij 15.871 xg bij 4°C gecentrifugeerd om afval te verwijderen, en de supernatantconcentratie werd bijgesteld tot 4 mg/ml met behulp van een BCA-eiwitassaykit (Beyotime, #P0009).Combineer 1 ml van het bovenstaande lysaat met 0,1 mM fotoafbreekbaar biotineazide (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0,1 mM TBTA-ligand (Aladdin, #T162437) en 1 mM CuSO4-incubator met bodem roteren gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.Voeg na een snelle reactie het mengsel toe aan de voorgemengde oplossing (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) in een glazen injectieflacon van 10 ml.De monsters werden gemengd en gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur bij 4500 g gecentrifugeerd.De onderste en bovenste oplossingen werden weggegooid, het precipitaat werd tweemaal gewassen met 1 ml methanol en 5 min bij 4°C bij 15871 x g gecentrifugeerd.Voeg 1 ml 8 M ureum (Aladdin, nr. U111902) in 25 mM ammoniumbicarbonaat (ABC, Aladdin, nr. A110539) toe om het neerslag op te lossen.Monsters werden gereconstitueerd met 10 mM dithiothreitol (Sangon, #A100281 in 25 mM ABC) gedurende 40 minuten bij 55°C, gevolgd door de toevoeging van 15 mM vers joodaceetamide (Sangon, #A600539) bij kamertemperatuur in het donker.Alkylering binnen 30 minuten..Er werd nog 5 mM dithiothreïtol toegevoegd om de reactie te stoppen.Bereid ongeveer 100 ul NeutrAvidin-agaroseparels (Thermo, #29202) voor elk monster door 3 keer te wassen met 1 ml PBS.De bovenstaande proteoomoplossing werd verdund met 5 ml PBS en gedurende 4 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met voorgewassen NeutrAvidine-agaroseparels.De korrels werden vervolgens 3 keer gewassen met 5 ml PBS met 0,2% SDS (Sangon, #A600485), 3 keer met 5 ml PBS met 1 M ureum en 3 keer met 5 ml ddH20.De kralen werden vervolgens geoogst door centrifugeren en opnieuw gesuspendeerd in 200 l 25 mM ABC dat 1 M ureum, 1 mM CaCl2 (Macklin, #C805228) en 20 ng/μl trypsine (Promega, #V5280) bevat.Trypsinize 's nachts bij 37 ° C met rotatie.De reactie werd gestopt door het toevoegen van mierenzuur (Thermo, # A117-50) totdat de pH 2-3 bereikte.De korrels werden 3 keer gewassen met 1 ml PBS die 0,2% SDS bevatte, 3 keer met 1 ml PBS die 1 M ureum bevat en vervolgens 3 keer met 1 ml gedestilleerd water.De gemodificeerde peptiden werden vrijgegeven door lysis van licht (365 nm) gedurende 90 minuten met 200 μl 70% MeOH.Na centrifugeren werd het supernatant verzameld.De kralen werden vervolgens eenmaal gewassen met 100 l 70% MeOH en de supernatanten werden samengevoegd.Monsters werden gedroogd in een Speedvac vacuümconcentrator en bewaard bij -20°C tot analyse.
Om singlet-zuurstofgemodificeerde peptiden te identificeren en te kwantificeren, werden monsters opnieuw opgelost in 0,1% mierenzuur en werd 1 μg peptiden geanalyseerd met behulp van een Orbitrap Fusion Lumos Tribrid-massaspectrometer uitgerust met een nano ESI-bron van Tune en Xcalibur van leverancierssoftware 4.3.Monsters werden gescheiden op een 75 µm x 15 cm intern gepakte capillaire kolom met 3 µm C18-materiaal (ReproSil-pur, #r13.b9.) en verbonden met een EASY-nLC 1200 UHPLC-systeem (Thermo).De peptiden werden gescheiden door lineaire gradiëntchromatografie van 95 minuten van 8% oplosmiddel B tot 50% oplosmiddel B (A = 0,1% mierenzuur in water, B = 0,1% mierenzuur in 80% acetonitril) en vervolgens lineair verhoogd tot 98% B min in 6 min bij een stroomsnelheid van 300 nl/min.Orbitrap Fusion Lumos verzamelt gegevens afwisselend tussen volledige MS-scan en MS2-scan, afhankelijk van de gegevens.De sputterspanning werd ingesteld op 2,1 kV en de temperatuur van het ionentransportcapillair was 320°C.MS-spectra (350-2000 m/z) werden verzameld met een resolutie van 120.000, AGC 4 × 105 en een maximale invoertijd van 150 ms.De 10 meest voorkomende meervoudig geladen voorlopers in elke volledige scan werden gefragmenteerd met behulp van HCD met een genormaliseerde botsingsenergie van 30%, een vierpolig isolatievenster van 1,6 m/z en een resolutie-instelling van 30.000.Een AGC-doel voor tandemmassaspectrometrie met 5 × 104 en maximale invoertijd 150 ms.De dynamische uitzondering is ingesteld op 30 seconden. Niet-toegewezen ionen of die met een lading van 1+ en >7+ werden afgewezen voor MS/MS. Niet-toegewezen ionen of die met een lading van 1+ en >7+ werden afgewezen voor MS/MS. еназначенные ионы или ионы с арядом 1+ и >7+ и отклонены для МС/МС. Niet-toegewezen ionen of ionen met een lading van 1+ en >7+ werden afgewezen voor MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ MS/MS。 еуказанные ионы или ионы с арядами 1+ и >7+ и отклонены для МС/МС. Niet-gespecificeerde ionen of ionen met ladingen van 1+ en >7+ werden afgewezen voor MS/MS.
De onbewerkte gegevens worden verwerkt met behulp van het FragPipe-computerplatform op basis van MSFragger.Massavooroordelen en overeenkomstige aminozuren werden bepaald met behulp van een open zoekalgoritme met een precursormassatolerantie van -150 tot 500 Da.Gemodificeerde peptiden werden vervolgens geïdentificeerd met behulp van histidine-modificaties met massawinsten van +229.0964 en +247.1069 Da in PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Cellen die het gefuseerde miniSOG-gen stabiel tot expressie brengen, werden uitgeplaat in schalen van 6 cm.Bij het bereiken van ~80% confluentie werden de cellen eenmaal gewassen met HBSS (Gibco, #14025092), vervolgens geïncubeerd met chemische probes in HBSS gedurende 1 uur bij 37°C en belicht met blauw licht.10W LED gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.Om te bepalen welk type reactieve zuurstofspecies betrokken is bij PDPL, 0,5 mM vitamine C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), 100 mM mannitol (Energy Chemical, #69-65-8), 100 M H202, 10 mM NaN3 werden als supplementen aan de cellen toegevoegd.Na wassen met koude PBS werden de cellen afgeschraapt, verzameld in centrifugebuizen van 1,5 ml en gesoniceerd met een punt gedurende 1 minuut in 200 l PBS met 1x proteaseremmer zonder EDTA (1 s en 1 s zonder, amplitude 35%).Het resulterende mengsel werd 10 minuten bij 15.871 x g bij 4 ° C gecentrifugeerd en de supernatantconcentratie werd aangepast tot 1 mg / ml met behulp van een BCA-eiwittestkit.Ongeveer 50 µl van het bovenstaande lysaat werd geïncubeerd met 0,1 mM rhodamineazide (Aladdin, nr. T131368), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA-ligand en 1 mM CuS04 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur onder rotatie van onder naar boven.Na de klikreactie werd precipitatie met aceton uitgevoerd door 250 l voorgekoelde aceton aan de monsters toe te voegen, 20 min bij -20°C te incuberen en 10 min bij 4°C bij 6010 x g te centrifugeren.Verzamel de pellet en kook in 50 ul van 1x Laemmli's buffer gedurende 10 minuten bij 95 ° C.Monsters werden vervolgens geanalyseerd op SDS-PAGE lange gels en gevisualiseerd met behulp van het Bio-rad ChemiDoc MP Touch-beeldvormingssysteem met Image Lab Touch-software.
Expressie en zuivering van het recombinante miniSOG-6xHis-eiwit werd uitgevoerd zoals eerder beschreven.In het kort, E. coli BL21(DE3)-cellen (TransGen, #CD701-02) werden getransformeerd met pET21a-miniSOG-6xHis en eiwitexpressie werd geïnduceerd met 0,5 mM IPTG (Sangon, #A600168).Na cellysis werden eiwitten gezuiverd met behulp van Ni-NTA-agaroseparels (MCE, nr. 70666), gedialyseerd tegen PBS en bewaard bij -80°C.
Voor een op antilichamen gebaseerde in vitro label nabijheidstest, meng 100 M gezuiverde miniSOG, 1 mM probe 3 en 1 ug anti-label muis monoklonaal antilichaam (TransGen, #HT501-01) in PBS tot een totaal reactievolume van 50 ul..Het reactiemengsel werd 0, 2, 5, 10 en 20 minuten bij kamertemperatuur bestraald met blauw LED-licht.Het mengsel werd geïncubeerd met 0,1 mM biotine-PEG3-azide (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA-ligand en 1 mM CuS04 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een schudapparaat met opwaartse beweging.Voeg na een snelle reactie 4x Laemmli's buffer direct toe aan het mengsel en kook gedurende 10 minuten bij 95 °C.Monsters werden geanalyseerd op SDS-PAGE-gels en geanalyseerd door western blotting met streptavidine-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).
Een histidine-bevattend synthetisch peptide met C-terminale amidering (LHDALDAK-CONH2) werd gebruikt om nabijgelegen op peptiden gebaseerde in vitro labeling te analyseren.In deze test werden 100 M gezuiverd miniSOG, 10 mM probe 3 en 2 μg/ml synthetisch peptide gemengd in PBS in een totaal reactievolume van 50 l.Het reactiemengsel werd 1 uur bij kamertemperatuur bestraald met blauw LED-licht.Eén microliter monster werd geanalyseerd met behulp van een LC-MS-systeem (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight massaspectrometer met MassLynx spectrumanalysesoftware).
HEK293T-cellen die het miniSOG-fusiegen stabiel tot expressie brengen, werden gezaaid in schalen van 10 cm voor lijnen met verschillende organellokalisatie (Mito, ER, Nucleus) en schalen van 15 cm voor Parkin-miniSOG- en BRD4-miniSOG-lijnen.Bij het bereiken van ~90% confluentie werden de cellen eenmaal gewassen met HBSS, vervolgens geïncubeerd met probe 3 in HBSS gedurende 1 uur bij 37°C en verlicht met een 10 W blauwe LED bij kamertemperatuur.Voor contactloze labeling van Parkin werd 10 µM protoncarbonylcyanidedrager m-chloorfenylhydrazon CCCP (Solarbio, #C6700) met probe 3 in HBSS gedurende 1 uur bij 37°C toegevoegd.De cellyse-, klikchemie-, reductie- en alkyleringsstappen waren dezelfde als hierboven beschreven, behalve dat 2 mg lysaat werd toegevoegd en biotine-PEG3-azide werd gebruikt in de klikreactie in plaats van fotoafbreekbaar biotineazide.Na verrijking werden de korrels 3 keer gewassen met 5 ml PBS dat 0,2% SDS bevat, 3 keer met 5 ml PBS dat 1 M ureum bevat, en 3 keer met 5 ml PBS.Daarna werd 2 µg trypsine toegevoegd aan 300 µl 25 mM ABC dat 1 M ureum bevatte om het eiwit een nacht bij 37°C te splitsen.De reactie werd gestopt door mierenzuur toe te voegen totdat een pH van 2-3 was bereikt.Na trypsinisatie op parels werd de peptideoplossing ontzout met behulp van een SOLAu HRP-kolom (Thermo, #60209-001) en gedroogd in een Speedvac vacuümconcentrator.Peptiden werden opnieuw opgelost in 0,1% mierenzuur en 500 ng peptiden werden geanalyseerd met behulp van een Orbitrap Fusion Lumos Tribrid massaspectrometer uitgerust met de hierboven beschreven nano-ESI-bron.Peptiden werden gescheiden op commerciële RP-HPLC-voorkolommen (75 m x 2 cm) (Thermo, nr. 164946) en analytische RP-HPLC-kolommen (75 m x 25 cm) (Thermo, nr. 164941), beide gevuld met 2 m.gradiënt van 8% naar 35% ACN in 60 minuten, daarna lineair verhoogd tot 98% B in 6 minuten bij een stroomsnelheid van 300 Nl/min.MS-spectra (350-1500 m/z) werden verzameld met een resolutie van 60.000, AGC 4 × 105 en een maximale invoertijd van 50 ms.Geselecteerde ionen werden achtereenvolgens gefragmenteerd door HCD in cycli van 3 s met een genormaliseerde botsingsenergie van 30%, een quadrupool isolatievenster van 1,6 m/z en een resolutie van 15000. Een 5 × 104 tandem massaspectrometer AGC-doel en een maximale injectietijd van 22 ms werden gebruikt.De dynamische uitsluiting is ingesteld op 45 seconden. Niet-toegewezen ionen of die met een lading van 1+ en >7+ werden afgewezen voor MS/MS. Niet-toegewezen ionen of die met een lading van 1+ en >7+ werden afgewezen voor MS/MS. еназначенные ионы или ионы с арядом 1+ и >7+ и отклонены для МС/МС. Niet-toegewezen ionen of ionen met een lading van 1+ en >7+ werden afgewezen voor MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ MS/MS。 еуказанные ионы или ионы с арядами 1+ и >7+ и отклонены для МС/МС. Niet-gespecificeerde ionen of ionen met ladingen van 1+ en >7+ werden afgewezen voor MS/MS.
De monstervoorbereidingsstappen tot aan de verrijking van de NeutrAvidin-korrels waren dezelfde als in de hierboven beschreven LC-MS/MS-analyse.Ongeveer 50 g lysaat werd gebruikt als input voor laadcontrole en 2 mg lysaat werd gebruikt voor klikreacties.Na verrijking en wassen met neutravidine werden de gebonden eiwitten geëlueerd door 50 ul Laemmli's buffer toe te voegen aan de agaroseharskorrels en 5 minuten te koken bij 95°C.Controlebelastinginvoer en met parels verrijkte monsters werden geanalyseerd met SDS-PAGE en overgebracht naar PVDF-membranen (Millipore, #ISEQ00010) met standaard Western-blot-methoden.De membranen werden geblokkeerd met 5% magere melk (Sangon, #A600669) in TBS met 0,1% tween-20 (TBST) en achtereenvolgens geïncubeerd met primaire en secundaire antilichamen.Primaire antilichamen werden 1:1000 verdund in 5% magere melk in TBST en overnacht bij 4°C geïncubeerd.Secundaire antilichamen werden gebruikt in een verhouding van 1:5000 en gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd.De membranen werden zichtbaar gemaakt door chemiluminescentie met behulp van het Chemidoc MP-beeldvormingssysteem.Alle ongesneden scans van blots en gels in de figuur worden gepresenteerd als onbewerkte gegevens.
Primaire antilichamen die in dit onderzoek werden gebruikt, waren onder meer konijnen-anti-SFPQ monoklonaal antilichaam (CST, nr. 71992), konijnen-anti-FUS monoklonaal antilichaam (CST, nr. 67840), konijnen-anti-NSUN2-polyklonaal antilichaam (Proteintech, nr. 20854-1- AP), konijn-anti-mSin3A polyklonaal antilichaam (Abcam, #ab3479), muis anti-tag monoklonaal antilichaam (TransGen, #HT201-02), muis anti-β-actine monoklonaal antilichaam (TransGen, #HC201-01), konijn - CDK2 monoklonaal antilichaam (ABclonal, #A0094), konijnen monoklonaal antilichaam tegen CTBP1 (ABclonal, #A11600), konijnen polyklonaal antilichaam tegen DUT (ABclonal, #A2901), konijnen polyklonaal antilichaam tegen PSMC4 (ABclonal, #A2505), konijnen anti- DNAJB1 polyklonaal antilichaam (ABclonal, # A5504).Deze antilichamen werden gebruikt in een verdunning van 1:1000 in 5% magere melk in TBST.De secundaire antilichamen die in deze studie werden gebruikt, omvatten anti-konijn IgG (TransGen, #HS101-01), anti-muis IgG (TransGen, #HS201-01) in een verdunning van 1:5000.
Om verder te onderzoeken of BRD4 interageert met SFPQ, werden stabiele HEK293T- en BRD4-miniSOG-cellen die HEK293T tot overexpressie brengen, uitgeplaat in schalen van 10 cm.Cellen werden gewassen met koude PBS en gelyseerd in 1 ml Pierce IP lysisbuffer (Thermo Fisher, #87787) met EDTA-vrije proteaseremmer gedurende 30 minuten bij 4°C.Daarna werden de lysaten verzameld in centrifugebuisjes van 1,5 ml en 10 min bij 4°C bij 15.871 xg gecentrifugeerd.Het supernatant werd geoogst en een nacht bij 4°C geïncubeerd met 5 µg anti-V5-gelabeld monoklonaal muisantilichaam (CST, #80076).Was ongeveer 50 ul eiwit A / G magnetische kralen (MCE, #HY-K0202) tweemaal met PBS met 0,5% Tween-20.Vervolgens werden de cellysaten gedurende 4 uur bij 4°C met magnetische korrels onder rotatie van onder naar boven geïncubeerd.Vervolgens werden de korrels vier keer gewassen met 1 ml PBST-buffer en gedurende 5 minuten bij 95°C gekookt.Monsters werden geanalyseerd op SDS-PAGE-gels en overgebracht naar PVDF-membranen met behulp van standaard Western-blot-methoden.De membranen werden geblokkeerd in 5% magere melk in TBST en achtereenvolgens geïncubeerd met primaire en secundaire antilichamen.Primair antilichaam Konijn anti-SFPQ monoklonaal antilichaam (CST, #71992) werd gebruikt in een verhouding van 1:1000 in 5% magere melk in TBST en overnacht geïncubeerd bij 4°C.Anti-konijn IgG werd gebruikt in een verhouding van 1:5000 en gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd.De membranen werden zichtbaar gemaakt door chemiluminescentie met behulp van het Chemidoc MP-beeldvormingssysteem.
Alle structuren die werden gebruikt voor de analyse van de Solvent Accessible Surface Area (SASA) werden verkregen uit de Protein Data Bank (PDB)52 of de AlphaFold Protein Structure Database53.Absolute SASA werd berekend voor elk residu met behulp van het FreeSASA-programma.Alleen volledige en ondubbelzinnige SASA-gegevens voor gelabeld histidine en zijn buren werden gebruikt om de gemiddelde SASA voor elke structuur te verkrijgen.De relatieve toegankelijkheid van het oplosmiddel (RSA) voor elk histidine werd berekend door de absolute SASA-waarde te delen door het empirisch maximaal mogelijke residuoppervlak dat beschikbaar is voor het oplosmiddel.Alle histidinen werden vervolgens geclassificeerd als verborgen als de gemiddelde RSA lager was dan 20%, anders blootgesteld56.
Raw-bestanden verkregen in DDA-modus werden doorzocht met Proteome Discoverer (v2.5) of MSfragger (Fragpipe v15.0) in de juiste SwissProt-geverifieerde eiwitdatabase die veelvoorkomende verontreinigingen bevat.De peptiden vereisten volledige trypsine met twee ontbrekende splitsingsplaatsen, carbamoylmethylering als een vaste modificatie en methionine-oxidatie als een dynamische modificatie.Precursor- en fragmentgewichtstoleranties werden ingesteld op respectievelijk 10 ppm en 0,02 Da (MS2 Orbitrap). Verontreinigende hits werden verwijderd en eiwitten werden gefilterd om een ​​valse ontdekkingssnelheid van <1% te verkrijgen. Verontreinigende hits werden verwijderd en eiwitten werden gefilterd om een ​​valse ontdekkingssnelheid van <1% te verkrijgen. опадания агрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэффициент ложного обнаружения <1%. Verontreinigende hits werden verwijderd en eiwitten werden gefilterd om een ​​foutdetectiepercentage van <1% op te leveren.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 опадания агрязняющих еществ были удалены, een елки отфильтрованы достижения овня ложных обнаружений <1%. Verontreinigende hits werden verwijderd en eiwitten werden gefilterd om een ​​vals-positief percentage van <1% te bereiken.Voor kwantitatieve analyse zonder het gebruik van labels werd genormaliseerd eiwitgehalte van drie biologische herhalingen gebruikt.Proteïne-subcellulaire lokalisatie-analyse werd uitgevoerd met behulp van Gene Ontology (GO) -analyse van DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 en databases samengesteld en gepubliceerd door de Alice Ting-groep.De vulkaankaart is verkregen van Perseus (v1.6.15.0). Veranderingen in het aantal vouwen van eiwit werden getest op statistische significantie met behulp van een tweezijdige t-test, en eiwithits werden geïdentificeerd met verandering in overvloed >2 (tenzij anders vermeld) en p-waarde <0,05. Veranderingen in het aantal vouwen van eiwit werden getest op statistische significantie met behulp van een tweezijdige t-test, en eiwithits werden geïdentificeerd met verandering in overvloed >2 (tenzij anders vermeld) en p-waarde <0,05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Veranderingen in het eiwitgehalte werden getest op statistische significantie met behulp van een tweezijdige t-test, en eiwitovereenkomsten werden geïdentificeerd met een inhoudsverandering >2 (tenzij anders vermeld) en een ap-waarde <0,05.使用双边t 检验测试蛋白质丰度倍数变化的统计显着性，并确定蛋白质命中的丰度变化> 2（除非另有说明）和p 值<0,05。使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍数 变化 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 （另 有 说明） 和 p 值 <0,05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. Statistische significantie van vouwveranderingen in eiwitgehalte werd getest met behulp van een tweezijdige t-test, en eiwitovereenkomsten werden bepaald voor inhoudsveranderingen> 2 (tenzij anders aangegeven) en p-waarden <0,05.Eiwitinteractieanalyse werd uitgevoerd met behulp van GO-analyse samen met de String-database.
Drie biologische replica's werden uitgevoerd met vergelijkbare resultaten.Statistische analyse werd gedaan met GraphPad Prism (GraphPad-software) en vulkaanplots werden gegenereerd met Perseus (v1.6.15.0).Om de twee groepen te vergelijken, werden p-waarden bepaald met behulp van een tweezijdige Student's t-test.Alleen singleton-eiwitten die ten minste tweemaal in de experimentele groep waren geïdentificeerd, werden opgenomen in de vulkaanplots en de bijbehorende ontbrekende waarden in de controlegroep werden vervangen door Perseus uit een normale verdeling, zodat de p-waarde kon worden berekend.Foutbalken vertegenwoordigen het gemiddelde ± standaarddeviatie.In proteomische analyses voor statistische analyse werd de overvloed aan eiwitten die in ten minste twee biologische replica's verschenen, behouden.Statistische methoden werden niet gebruikt om de steekproefomvang vooraf te bepalen.De experimenten zijn niet willekeurig.De onderzoekers waren niet blind voor de taken tijdens het experiment en de evaluatie van de resultaten.
Voor meer informatie over onderzoeksopzet, zie de Nature Research Report abstract gekoppeld aan dit artikel.
De massaspectrometriegegevens die in dit onderzoek zijn verkregen, zijn ingediend bij het ProteomeXchange Consortium via de iProX57-partnerrepository onder dataset-ID PXD034811 (PDPL-MS-dataset).Ruwe gegevens worden geleverd in de vorm van onbewerkte gegevensbestanden.Dit artikel bevat de oorspronkelijke gegevens.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. De buurt leren kennen: nabijheidsafhankelijke biotinylatie gebruiken om eiwitcomplexen te karakteriseren en organellen in kaart te brengen. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. De buurt leren kennen: nabijheidsafhankelijke biotinylatie gebruiken om eiwitcomplexen te karakteriseren en organellen in kaart te brengen.Gingras, AS, Abe, KT en Raut, B. Bekendheid met de omgeving: gebruik van nabijheidsafhankelijke biotinylering om eiwitcomplexen te karakteriseren en organellen in kaart te brengen. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. De buurt begrijpen: gebruik de afhankelijkheid van de buurt van biologisch leven.Gingras, AS, Abe, KT en Raut, B. Nabijheid begrijpen: karakterisering van eiwitcomplexen en in kaart brengen van organellen met behulp van nabijheidsafhankelijke biotinylering.Huidig.Mijn mening.Chemisch.biologie 48, 44-54 (2019).
Geri, JB et al.De micro-omgeving in kaart brengen door Dexter-energie over te dragen aan immuuncellen.Wetenschap 367, 1091-1097 (2020).
Hertling, EL et al.Twee-proteoomschaalnetwerken detecteren celspecifieke hermodellering van het menselijke interactoom.Cellen 184, 3022-3040.e3028 (2021).