Nieuws

Traditionele diagnostische strategieën voor het opsporen van infectieziekten vereisen het gebruik van benchtop-instrumenten die niet geschikt zijn voor point-of-care-testen (POCT).Opkomende microfluïdica is een sterk geminiaturiseerde, geautomatiseerde en geïntegreerde technologie die een potentieel alternatief is voor traditionele methoden voor snelle, goedkope en nauwkeurige diagnostiek ter plaatse.Moleculaire diagnostische methoden worden veel gebruikt in microfluïdische apparaten als de meest effectieve methoden voor detectie van pathogenen.Deze review vat recente vorderingen samen in op microfluïdische gebaseerde moleculaire diagnostiek van infectieziekten vanuit zowel een academisch als industrieel perspectief.Eerst beschrijven we een typische on-chip verwerking van nucleïnezuren, inclusief monstervoorbehandeling, amplificatie en signaallezing.Vervolgens worden de kenmerken, voor- en nadelen van de vier soorten microfluïdische platformen vergeleken.Vervolgens bespreken we het gebruik van digitale testen voor de absolute kwantificering van nucleïnezuren.Zowel klassieke als recente commerciële op microfluïdische gebaseerde moleculaire diagnostische apparaten worden samengevat als bewijs van de huidige staat van de markt.Ten slotte stellen we toekomstige richtingen voor microfluïdische diagnose van infectieziekten voor.
Infectieziekten worden veroorzaakt door ziekteverwekkers, waaronder bacteriën, virussen en parasieten, die over de hele wereld worden verspreid.In tegenstelling tot andere ziekten raken ziekteverwekkers snel geïnfecteerd en verspreiden ze zich tussen mens en gastdier door middel van inoculatie, lucht en water [1].Preventie van infectieziekten is van cruciaal belang als maatregel voor de volksgezondheid.Drie hoofdstrategieën voor de bestrijding van infectieziekten: (1) de bron van infectie beheersen;(2) onderbreking van het transmissiepad;(3) bescherming van vatbare populaties.Van de belangrijkste strategieën wordt beheersing van de infectiebron beschouwd als de belangrijkste strategie vanwege het gemak en de lage kosten.Snelle diagnose, isolatie en behandeling van geïnfecteerde personen zijn van cruciaal belang en vereisen snelle, gevoelige en nauwkeurige diagnostische strategieën [2].De huidige diagnose van infectieziekten combineert meestal klinisch onderzoek op basis van tekenen en symptomen en laboratoriumonderzoek zoals celkweek en moleculaire diagnostiek, waarvoor geschoold personeel, arbeidsintensieve procedures en dure testapparatuur nodig zijn [3, 4].Preventie van uitbraken van infectieziekten vereist een snelle, goedkope en nauwkeurige lokale diagnose, vooral in gebieden met beperkte middelen waar infectieziekten veel voorkomend en ernstig zijn [5], evenals behandeling in de wildernis of op het slagveld, waar noodsituaties onvoorspelbaar zijn..medische zorg is beperkt [6].In deze context is microfluïdica een technologie die micro-elektromechanische systeemtechnologieën, nanotechnologie of materiaalwetenschap combineert voor nauwkeurige vloeistofmanipulatie [7,8,9,10], wat nieuwe mogelijkheden biedt voor point-of-care-detectie (POCT).) infectieuze agentia buiten ziekenhuizen en laboratoria.Vergeleken met traditionele tijdrovende diagnostiek biedt microfluïdische technologie monster- en kostenbesparingen voor moleculaire diagnostiek tijdens ziekte-uitbraken.De wereldwijde verspreiding van coronavirusziekte 2019 (COVID-19) wordt veroorzaakt door het ernstige acute respiratoire syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2), dus het belang van microfluïdica voor de tijdige preventie en bestrijding van de pandemie wordt opnieuw benadrukt [11, 12 , 13].In tegenstelling tot traditionele diagnostiek, gebruikt microfluïdische POCT kleine draagbare apparaten, variërend van benchtop-analysatoren tot kleine sidestream-teststrips om te testen in de buurt van het bemonsteringspunt [14].Deze tests hebben een simplistische of geen monstervoorbereiding, snelle signaalversterking en gevoelige signaalmetingen, wat resulteert in korte duur en nauwkeurige resultaten binnen enkele minuten.De beschikbaarheid en massaproductie van op microfluïdische instrumenten gebaseerde gezondheidszorginstrumenten hebben hun kosteneffectieve en directe diagnostische toepassingen buiten het ziekenhuis, in de buurt van de patiënt en zelfs thuis uitgebreid.
Van de bestaande strategieën voor het diagnosticeren van infectieziekten is moleculaire diagnostiek een van de meest gevoelige [15, 16].Bovendien wordt moleculaire diagnostiek vaak gebruikt als de gouden standaard voor continue detectie van COVID-19, waardoor directe detectie van virusspecifieke regio's van RNA of DNA mogelijk is vóór het begin van een immuunrespons [17, 18].In de huidige review presenteren we de nieuwste ontwikkelingen in op microfluïdica gebaseerde moleculaire diagnostische processen voor infectieziekten, vanuit een academisch perspectief naar toekomstige industriële perspectieven (Fig. 1).We beginnen met drie belangrijke stappen in de detectie van nucleïnezuur: voorbehandeling van monsters op de chip, amplificatie van nucleïnezuur en aflezen van signalen.Vervolgens vergeleken we verschillende soorten microfluïdische platforms met hun structuur en functie, met unieke kenmerken (sterke en zwakke punten).Digitale nucleïnezuurdetectie wordt verder besproken en gegeven als een voorbeeld van een derde generatie technologie voor de absolute kwantificering van infectieuze pathogene moleculen.Daarnaast zullen verschillende typische en nieuwste commerciële POCT-apparaten worden gepresenteerd om de huidige staat van de microfluïdische POCT-markt voor moleculaire diagnostiek te demonstreren.Ook zullen we onze visie voor toekomstige toepassingen bespreken en toelichten.
Modules van microfluïdische chips voor nucleïnezuurdetectie kunnen worden onderverdeeld in drie categorieën (bemonstering, herkenning en signalering) op basis van hun functies [19].Van deze modules realiseert de monsternamemodule voornamelijk monsterlysis en nucleïnezuurextractie.De sensormodule regelt voornamelijk de conversie en amplificatie van nucleïnezuursignalen.De signaleringsmodule detecteert het signaal dat door de sensormodule is omgezet en verwerkt.Op basis van het proces van het detecteren van nucleïnezuren op een chip, zullen we de verschillende chips samenvatten die de "input en output" -functie kunnen realiseren.
De eerste stap bij de detectie van nucleïnezuur is nucleïnezuurextractie, dwz het isoleren van het doelnucleïnezuur uit het oorspronkelijke monster.Nucleïnezuurextractie wordt uitgevoerd om nucleïnezuren te zuiveren van andere moleculaire verontreinigingen, de integriteit van de primaire structuur van nucleïnezuurmoleculen te waarborgen en de resultaten te optimaliseren.Nucleïnezuurextractie vereist de nodige lysis van monsters en nucleïnezuurvangst, waarvan de kwaliteit en efficiëntie een enorme impact hebben op onderzoeks- en diagnostische resultaten.Eventuele subtiele bijwerkingen tijdens extractie kunnen verdere detectie beperken.Zo worden polymerasekettingreactie (PCR) en lus-isotherm amplificatie (LAMP)-methoden geremd door sommige resterende organische oplosmiddelen zoals ethanol en isopropanol in nucleïnezuurisolatiereagentia [20].Vloeistof-vloeistofextractie en vastefase-extractie zijn de meest populaire methoden voor het isoleren van nucleïnezuren [21], maar vloeistof-vloeistofextractie op een chip is uiterst beperkt, omdat de reagentia die worden gebruikt bij vloeistof-vloeistofextractie corrosie van de meeste microfluïdische chips veroorzaken .Hier belichten we op microarray gebaseerde vastefase-extractiemethoden en vergelijken we hun voor- en nadelen.
Silicium is een substraatmateriaal dat compatibel is met nucleïnezuren vanwege zijn biocompatibiliteit, stabiliteit en gemak van modificatie [22].Belangrijk is dat, wanneer gemodificeerd met silica of andere materialen, deze composiet eigenschappen vertoont om negatief geladen nucleïnezuren te adsorberen onder lage pH, hoge zoutomstandigheden, terwijl geëlueerd wordt met hoge pH, lage zoutoplossingen.Op basis van dit fenomeen is het mogelijk om het nucleïnezuur te zuiveren.
Verschillende vormen van op silica gebaseerde materialen zijn gebruikt voor nucleïnezuurextractie in microfluïdica, zoals silicaparels, poeders, microvezelfilters en silicamembranen [23, 24, 25, 26].Afhankelijk van de eigenschappen van het materiaal kunnen materialen op basis van silicium op verschillende manieren in microschakelingen worden gebruikt.Silicakorrels, poeders en commerciële nanofilters kunnen bijvoorbeeld eenvoudig in de poriën of microkanalen van microfluïdische chips worden geplaatst en helpen nucleïnezuren uit monsters te extraheren [27, 28, 29].Oppervlak-gemodificeerde silicamembranen kunnen ook worden gebruikt om DNA snel en tegen lage kosten van pathogenen te zuiveren.Wang et al.[30] Door denaturerende amplificatiereacties te combineren met door blaasjes gemedieerde ketenuitwisseling met silicamembranen gecoat met chitosan-oligosacchariden, werd een veelzijdig draagbaar systeem geïntroduceerd dat met succes 102-108 kolonievormende eenheden detecteerde.(KVE)/ml Vibrio parahaemolyticus., en de aanwezigheid van het virus was goed zichtbaar.Powell et al.[31] Microarrays op basis van silicium werden vervolgens gebruikt om het hepatitis C-virus (HCV), het humaan immunodeficiëntievirus (HIV), het zikavirus en het humaan papillomavirus te detecteren en automatische vermeerdering, waarbij een kronkelige microreactor van 1,3 l werd ontwikkeld om RNA-virussen te vangen.en in situ versterking uit te voeren.Naast deze methoden spelen microkolommen met aan het oppervlak gemodificeerde silica ook een sleutelrol bij de extractie van nucleïnezuur, aangezien de geometrie en eigenschappen van het modificerende materiaal de extractie-efficiëntie aanzienlijk verhogen.Chen et al.[32] stelde een microfluïdisch platform voor voor isolatie van RNA met een lage concentratie op basis van met amino gecoate siliciummicrokolommen.Dit microfluïdische apparaat integreert een reeks van 0,25 cm2 micropilaren op een siliciumsubstraat om een ​​hogere extractie-efficiëntie te bereiken door een ontwerp met een hoog oppervlak tot volumeverhouding.Het voordeel van dit ontwerp is dat het microfluïdische apparaat tot 95% nucleïnezuurextractie-efficiëntie kan bereiken.Deze op silicium gebaseerde strategieën demonstreren de waarde van het snel isoleren van nucleïnezuren tegen lage kosten.In combinatie met microfluïdische chips kunnen op silicium gebaseerde extractiestrategieën niet alleen de efficiëntie van nucleïnezuurdetectie verhogen, maar ook de miniaturisatie en integratie van analytische apparaten vergemakkelijken [20].
Magnetische scheidingsmethoden gebruiken magnetische deeltjes om nucleïnezuren te isoleren in de aanwezigheid van een extern magnetisch veld.Veelgebruikte magnetische deeltjes omvatten Fe3O4 of γ-Fe2O3 magnetische deeltjes die zijn gecoat met silica, amino en carboxyl [33,34,35,36].Het onderscheidende kenmerk van magnetische deeltjes in vergelijking met op silicium gebaseerde SPE-methoden is het gemak van manipulatie en controle met externe magneten.
Met behulp van de elektrostatische interactie tussen nucleïnezuren en silica, onder omstandigheden met een hoog zoutgehalte en een lage pH, worden nucleïnezuren geadsorbeerd op het oppervlak van met silica gecoate magnetische deeltjes, terwijl onder omstandigheden van een laag zoutgehalte en een hoge pH de moleculen kunnen worden gewassen opnieuw..Met silica gecoate magnetische kralen maken het mogelijk om DNA te extraheren uit monsters met een groot volume (400 L) met behulp van magnetisch gecontroleerde beweging [37].Als demonstratie hebben Rodriguez-Mateos et al.[38] gebruikte afstembare magneten om de overdracht van magnetische kralen naar verschillende kamers te regelen.Op basis van met silica gecoate magnetische deeltjes kunnen 470 kopieën/ml SARS-CoV-2 genomisch RNA worden geëxtraheerd uit afvalwatermonsters voor LAMP-reverse-transcriptiedetectie (RT-LAMP) en de respons kan binnen 1 uur worden afgelezen.blote oog (Fig. 2a).
Apparaten op basis van magnetische en poreuze materialen.Conceptueel diagram van het IFAST RT-LAMP microfluïdische apparaat voor SARS-CoV-2 RNA-detectie (aangepast van [38]).b Centrifugaal microapparaat voor dSPE van nucleïnezuur van buccale uitstrijkjes (aangepast van [39]).c Ingebouwde zelfaangedreven monsterconcentrator met behulp van een FTA®-kaart (aangepast van [50]).d Fusion 5-filterpapier gemodificeerd met chitosan (overgenomen van [51]).SARS-CoV-2 ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2, RT-LAMP reverse transcription loop gemedieerde isotherme amplificatie, FTA-vinders technologiepartners, NA nucleïnezuur
Positief geladen magnetische deeltjes zijn ideaal voor het bevestigen van de fosfaatruggengraat van een nucleïnezuur.Bij een bepaalde zoutconcentratie kunnen de negatief geladen fosfaatgroepen van nucleïnezuren positief geladen zijn op het oppervlak van de magnetische composietdeeltjes.Daarom werden magnetische nanodeeltjes met een ruw oppervlak en een hoge dichtheid aan aminogroepen ontwikkeld voor de extractie van nucleïnezuren.Na magnetische scheiding en blokkering kunnen magnetische nanodeeltjes en DNA-complexen direct worden gebruikt in PCR, waardoor complexe en tijdrovende zuiverings- en elutiebewerkingen niet meer nodig zijn [35].Magnetische nanodeeltjes gecoat met negatieve carboxylgroepen zijn ook gebruikt om nucleïnezuren te scheiden die op oppervlakken zijn geadsorbeerd in polyethyleenglycol- en natriumchlorideoplossingen met een hoge concentratie [36].Met deze aan het oppervlak gemodificeerde magnetische kralen is DNA-extractie compatibel met daaropvolgende amplificatie.Dignan et al.[39] beschreef een geautomatiseerd en draagbaar centrifugaal microfluïdisch platform voor nucleïnezuurvoorbehandeling, waardoor niet-technisch personeel het ter plaatse kan gebruiken.Bovendien demonstreert de compatibiliteit van het geïsoleerde DNA met LAMP, een methode die zeer geschikt is voor point-of-care nucleïnezuuranalyse, verder minimale apparatuurvereisten en geschiktheid voor colorimetrische testen (Fig. 2b).
Magnetische parelmethoden bieden de mogelijkheid van geautomatiseerde extractie, waarvan sommige bestaan ​​in commerciële geautomatiseerde nucleïnezuurextractors [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, VS), QIAcube® HT;CapitalBio (Beijing, China) en Biomek®;Beckman (Miami, VS).), Florida, VS)].De voordelen van het combineren van magnetische korrels met microfluïdica kunnen worden gebruikt voor efficiënte geautomatiseerde extractie van nucleïnezuren, wat mogelijk de ontwikkeling van moleculaire diagnostiek zou kunnen bevorderen;de combinatie van magnetische kralen met microfluïdica is echter nog steeds sterk afhankelijk van complexe besturingssystemen voor nauwkeurige manipulatie van magnetische kralen, wat de populariteit verklaart van commerciële producten die omvangrijk en duur zijn, wat de verdere toepassing van magnetische kralen in POCT beperkt.
Verschillende poreuze materialen zoals gemodificeerde nitrocellulosefilters, Finders Technology Associates (FTA)-kaarten, op polyethersulfon gebaseerde filterpapieren en met glycaan gecoate materialen zijn ook gebruikt voor nucleïnezuurdetectie [40, 41, 42, 43, 44].Poreuze vezelachtige materialen zoals vezelig papier werden voor het eerst gebruikt om DNA te isoleren door langstrengige DNA-moleculen fysiek met vezels te verstrengelen.Kleine poriën leiden tot een sterke fysieke beperking van DNA-moleculen, wat de DNA-extractie positief beïnvloedt.Vanwege de verschillende poriegroottes van vezelig papier kan de extractie-efficiëntie niet voldoen aan de behoeften van DNA-amplificatie [45, 46].De FTA-kaart is een commercieel filterpapier dat wordt gebruikt op het gebied van forensische geneeskunde en dat veel wordt gebruikt in andere gebieden van moleculaire diagnostiek.Door het gebruik van cellulosefilterpapier geïmpregneerd met verschillende chemicaliën om de celmembranen in het monster te lyseren, wordt het vrijgekomen DNA tot 2 jaar beschermd tegen afbraak.Meer recentelijk is geïmpregneerd cellulosepapier ontwikkeld voor moleculaire detectie van verschillende pathogenen, waaronder SARS-CoV-2, leishmaniasis en malaria [47,48,49].HIV in het geïsoleerde plasma wordt direct gelyseerd en het virale nucleïnezuur is verrijkt in het FTA®-stroommembraan dat in de concentrator is ingebouwd, wat een efficiënte productie van het nucleïnezuur mogelijk maakt [50] (Fig. 2c).Het grootste probleem met nucleïnezuurdetectie met behulp van FTA-kaarten is dat chemicaliën zoals guanidine en isopropanol daaropvolgende amplificatiereacties remmen.Om dit probleem op te lossen, hebben we Fusion 5 chitosan-gemodificeerd filterpapier ontwikkeld, dat de voordelen combineert van zowel de fysieke interliniëring van DNA-moleculen en vezelig filterpapier, als de elektrostatische adsorptie van DNA op met chitosan gemodificeerde verbindingen om een ​​zeer efficiënte nucleïnezuurextractie te verkrijgen ..filtervezels [51] (Fig. 2d).Evenzo Zhu et al.[52] demonstreerde een chitosan-gemodificeerde PCR-methode op basis van een in situ capillair microfluïdisch systeem voor snelle isolatie en detectie van Zika-virus-RNA.Nucleïnezuren kunnen respectievelijk worden geadsorbeerd/gedesorbeerd in een gemengd lysaat/PCR-medium, gebaseerd op de aan/uit-schakelaareigenschap van chitosan.aan en uit”, reagerend op pH.
Zoals hierboven vermeld, combineren deze strategieën de voordelen van verschillende vaste-fasematerialen en verhogen ze de efficiëntie van nucleïnezuurextractie in microfluïdica.In praktische toepassingen is het gebruik van deze materialen in grote hoeveelheden oneconomisch, en een juiste oppervlaktebehandeling of oppervlaktemodificatie van gebruikelijke materialen met deze materialen kan ook hun functie behouden.Daarom wordt aangenomen dat de implementatie van deze strategieën na een pilotstudie de kosten kan verlagen.
Nucleïnezuurtesten op microfluïdische platforms maken vaak gebruik van kleine monstervolumes (< 100 µl), daarom is amplificatie van de doelnucleïnezuren met specifieke probes nodig voor conversie naar een signaal dat handig is voor stroomafwaartse detectie (optisch, elektrisch en magnetisch) [53, 54]. Nucleïnezuurtesten op microfluïdische platforms maken vaak gebruik van kleine monstervolumes (< 100 µl), daarom is amplificatie van de doelnucleïnezuren met specifieke probes nodig voor conversie naar een signaal dat handig is voor stroomafwaartse detectie (optisch, elektrisch en magnetisch) [53, 54]. При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. Bij het testen van nucleïnezuren op microfluïdische platforms worden vaak kleine monstervolumes (<100 µL) gebruikt, dus de amplificatie van doelnucleïnezuren met speciale sondes is vereist om het om te zetten in een signaal dat geschikt is voor latere detectie (optisch, elektrisch en magnetisch) [53, 54].微流控平台上的核酸检测通常使用小样本量（< 100 µl），因此需要使用特定探针扩增目标核酸，以转换为便于下游检测（光学、电学和磁学）的信号[53, 54 ]。微流控 平台 上 的 核酸 检测 使用 小样本量 （（<100 µl） ， 因此 需要 特定 探针 扩增 目标 ， 以 转换 为 下游 下游 （光学 、 电学 磁学） 的 信号 [53, 54, 54, 54 ]。 Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. Detectie van nucleïnezuren op microfluïdische platforms maakt meestal gebruik van kleine monstervolumes (<100 l), waarvoor amplificatie van doelnucleïnezuren met speciale probes nodig is om ze om te zetten in signalen voor daaropvolgende detectie (optisch, elektrisch en magnetisch) [53, 54]] .Nucleïnezuuramplificatie in microfluïdica kan ook reacties versnellen, detectielimieten optimaliseren, monstervereisten verminderen en de detectienauwkeurigheid verbeteren [55, 56].In de afgelopen jaren zijn, met de realisatie van snelle en nauwkeurige detectie, verschillende nucleïnezuuramplificatiemethoden toegepast in microfluïdica, waaronder PCR en enkele isotherme amplificatiereacties.In deze sectie worden methoden voor nucleïnezuurdetectie samengevat op basis van microfluïdische systemen.
PCR is een simulatie van het DNA-replicatieproces van een organisme, waarvan de theorie elders uitvoerig wordt beschreven en hier niet zal worden besproken.PCR kan een zeer kleine hoeveelheid doel-DNA/RNA met een exponentiële snelheid amplificeren, waardoor PCR een krachtig hulpmiddel is voor de snelle detectie van nucleïnezuren.In de afgelopen decennia zijn veel draagbare microfluïdische apparaten uitgerust met PCR-thermische cyclische systemen ontwikkeld om te voldoen aan de behoeften van point-of-care-diagnostiek [57, 58].On-chip PCR kan worden onderverdeeld in vier typen (conventionele, continue stroom, ruimtelijk geschakelde en convectieve PCR) volgens verschillende temperatuurregelmethoden [59].Bijvoorbeeld Gee et al.[60] ontwikkelden een directe reverse transcriptie kwantitatieve PCR (RT-qPCR) -methode op hun eigen microfluïdische platform voor de multiplexdetectie van SARS-CoV-2, influenza A- en B-virussen in keeluitstrijkjes (Fig. 3a).Park et al.[61] bouwde een eenvoudige pathogenenanalysechip door dunne film PCR, elektroden en een met de vinger bediende microfluïdische module op basis van polydimethylsiloxaan te integreren.Beide werken belichamen echter de gemeenschappelijke tekortkomingen van conventionele PCR.PCR vereist thermische cycli, wat verdere miniaturisatie van het apparaat en een kortere testtijd beperkt.
De ontwikkeling van op continue stroom gebaseerde microfluïdische en ruimtegeschakelde PCR is van cruciaal belang om dit probleem aan te pakken.Door gebruik te maken van een lang kronkelig kanaal of een kort recht kanaal, kan PCR met continue stroom snelle versterking bieden door actief circulerende reagentia in drie voorverwarmingszones met een off-chip pomp.Deze operatie vermijdt met succes de overgangsfase tussen verschillende reactietemperaturen en vermindert zo de testtijd [62] (figuur 3b).In een andere studie van Jung et al.[63] stelde een nieuwe roterende PCR-genetische analysator voor die de kenmerken van vaste en stroom-PCR combineert voor ultrasnelle en multiplex omgekeerde transcriptie-PCR (figuur 3c).Voor nucleïnezuuramplificatie zal de PCR-microchip door drie verwarmingsblokken bij verschillende temperaturen worden geroteerd: 1. Denaturatieblok 94°C, 2. Gloeiblok bij 58°C, 3. Expansieblok bij 72°C.
Toepassing van PCR in microfluïdica.Schematische weergave van dirRT-qPCR op een microfluïdisch platform (aangepast van [60]).b Schematische weergave van een PCR-microarray met continue stroom op basis van een serpentinekanaal (aangepast van [62]).c Schematische weergave van een roterende genetische PCR-analysator, bestaande uit een microchip, drie verwarmingsblokken en een stappenmotor (overgenomen van [63]).d Schema van thermoconvectie PCR met centrifugatie en opstelling (aangepast van [64]).DirRT-qPCR, directe kwantitatieve reverse transcriptie polymerase kettingreactie
Met behulp van capillairen en lussen of zelfs dunne platen, kan convectie-PCR nucleïnezuren snel amplificeren door natuurlijke vrije thermische convectie zonder dat een externe pomp nodig is.Er werd bijvoorbeeld een microfluïdisch platform van cyclisch olefinepolymeer ontwikkeld op een gefabriceerde roterende verwarmingstrap die gebruik maakt van thermische cycli met centrifugatie in een PCR-lusmicrokanaal [64] (Fig. 3d).De reactieoplossing wordt aangedreven door thermische convectie, die continu hoge en lage temperaturen uitwisselt in een microkanaal met een ringvormige structuur.Het hele versterkingsproces kan in 10 minuten worden voltooid met een detectielimiet van 70,5 pg/kanaal.
Zoals verwacht is snelle PCR een krachtig hulpmiddel voor volledig geïntegreerde systemen voor moleculaire diagnostiek en multiplexanalyse van monsters.Snelle PCR vermindert de tijd die nodig is om SARS-CoV-2 te detecteren aanzienlijk, wat bijdraagt ​​aan de effectieve beheersing van de COVID-19-pandemie.
PCR vereist een complexe thermische cycler die niet geschikt is voor POCT.Meer recentelijk zijn isothermische amplificatietechnieken toegepast op microfluïdica, waaronder maar niet beperkt tot LAMP, recombinase polymerase amplificatie (RPA) en amplificatie op basis van nucleïnezuursequenties [65,66,67,68].Met deze technieken worden nucleïnezuren geamplificeerd bij een constante temperatuur, wat de creatie van goedkope, zeer gevoelige draagbare POCT-apparaten voor moleculaire diagnostiek mogelijk maakt.
Op microfluïdica gebaseerde LAMP-assays met hoge doorvoer maken meerdere detectie van infectieziekten mogelijk [42, 69, 70, 71].In combinatie met een centrifugaal microfluïdisch systeem kan LAMP de automatisering van nucleïnezuurdetectie verder vergemakkelijken [69, 72, 73, 74, 75].De spin-and-react SlipChip is ontwikkeld voor de visuele detectie van meerdere parallelle bacteriën met behulp van LAMP [76] (Fig. 4a).Bij gebruik van geoptimaliseerde LAMP in de test was de fluorescentiesignaal-ruisverhouding ongeveer 5-voudig en bereikte de detectielimiet 7,2 kopieën/μl genomisch DNA. Bovendien werd het bestaan ​​van vijf veel voorkomende bacteriële pathogenen in het spijsverteringskanaal, waaronder Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis en Vibrio parahaemolyticus, in < 60 minuten gevisualiseerd op basis van de methode. Bovendien werd het bestaan ​​van vijf veel voorkomende bacteriële pathogenen in het spijsverteringskanaal, waaronder Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis en Vibrio parahaemolyticus, in < 60 minuten gevisualiseerd op basis van de methode.Bovendien werd met deze methode in minder dan 60 minuten de aanwezigheid van vijf veelvoorkomende bacteriële pathogenen van het spijsverteringskanaal, waaronder Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis en Vibrio parahaemolyticus, gevisualiseerd.此外，基于该方法在<60分钟内可视化了五种常见消化道细菌病原体的存在，包括蜡状芽孢杆菌、大肠杆菌、肠沙门氏菌、河流弧菌和副溶血性弧菌。此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 视化 了 五 种 常见 消化道 细菌病 的 存在 ， 包括 芽孢杆菌 、 大 肠杆菌 、 肠 氏 菌 、 弧菌 和 副溶血性。。。 弧菌 弧菌 弧菌弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 HIPBovendien werd de aanwezigheid van vijf veel voorkomende bacteriële gastro-intestinale pathogenen, waaronder Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius en Vibrio parahaemolyticus, in minder dan 60 minuten gevisualiseerd met behulp van deze methode.
De voordelen van LAMP in microfluïdica zijn onder andere een snelle respons en geminiaturiseerde detectie.Vanwege de reactietemperatuur (rond 70°C) worden er echter onvermijdelijk aerosolen gegenereerd tijdens LAMP, wat resulteert in een hoog percentage valse positieven.Assayspecificiteit, primerontwerp en temperatuurregeling moeten ook worden geoptimaliseerd voor LAMP.Bovendien zijn chipontwerpen die detectie van meerdere doelen op een enkele chip implementeren van grote waarde en moeten ze worden ontwikkeld.Daarnaast is LAMP geschikt voor multifunctionele detectie geïntegreerd in één chip, wat van groot belang is, maar er is nog veel ruimte voor ontwikkeling.
Het hoge percentage valse positieven van LAMP kan deels worden verminderd met RPA, aangezien de relatief lage reactietemperatuur (~37 °C) relatief weinig verdampingsproblemen veroorzaakt [77].In het RPA-systeem initiëren twee tegenovergestelde primers DNA-synthese door te binden aan een recombinase en amplificatie kan binnen 10 minuten worden voltooid [78,79,80,81].Daarom is het hele RPA-proces veel sneller dan PCR of LAMP.In de afgelopen jaren is aangetoond dat microfluïdische technologie de snelheid en nauwkeurigheid van RPA verder verbetert [82,83,84].Bijvoorbeeld, Liu et al.[85] ontwikkelde een microfluïdische geïntegreerde laterale-flow-polymerase-recombinase-amplificatietest voor snelle en gevoelige detectie van SARS-CoV-2 door integratie van reverse transcriptie RPA (RT-RPA) en een universeel detectiesysteem voor laterale-flow-teststrips.in een enkel microfluïdisch systeem.Figuur 4b).De detectielimiet is 1 kopie/µl of 30 kopieën/monster, en de detectie kan in ongeveer 30 minuten worden voltooid.Kong et al.hebben een draagbaar microfluïdisch apparaat ontwikkeld.[86] gebruikte lichaamstemperatuur en een fluorescentiedetectiesysteem op basis van mobiele telefoons om hiv-1-DNA snel en direct te detecteren met behulp van RPA (Figuur 4c).De draagbare RPA-assay detecteert 100 kopieën/ml van de doelsequentie binnen 24 minuten, wat een groot potentieel aantoont voor een snelle diagnose van met HIV-1 geïnfecteerde baby's in omgevingen met beperkte middelen.
Isotherme versterking in point-of-care-testen (POCT).Ontwikkeling en productie van spin en reactie SlipChip.Na plasmalassen werden de bovenste en onderste chips met een set moeren geassembleerd om de uiteindelijke chip te vormen (aangepast van [76]).b Schema van het MI-IF-RPA-systeem voor COVID-19-detectie (aangepast van [85]).c Schema van een draagbare RPA-test voor snelle detectie van HIV-1-DNA (overgenomen van [86]).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM carboxyfluoresceïne, humaan immunodeficiëntievirus HIV, RPA recombinase polymerase amplificatie, LED light emitting diode, MI-IF-RPA Microfluidics Integrated Lateral Flow Recombinase- Polymerase versterking
Op microfluïdische gebaseerde RPA ontwikkelt zich snel, maar de kosten van chipfabricage en reactieverbruik zijn te hoog en moeten worden verlaagd om de beschikbaarheid van deze technologie te vergroten.Bovendien kan de hoge gevoeligheid van RPA de amplificatie van niet-specifieke producten beïnvloeden, vooral in aanwezigheid van verontreiniging.Deze beperkingen kunnen de toepassing van RPA in microfluïdische systemen beïnvloeden en verdere optimalisatie verdienen.Goed ontworpen primers en probes voor verschillende doelen zijn ook nodig om de haalbaarheid van op RPA gebaseerde microfluïdische strategieën in POCT te verbeteren.
Cas13 en Cas12a hebben het vermogen om nucleïnezuren willekeurig te splitsen en kunnen dus worden ontwikkeld als detectie- en diagnostische hulpmiddelen.Cas13 en Cas12a worden geactiveerd na binding aan respectievelijk doelwit-DNA of -RNA.Eenmaal geactiveerd, begint het eiwit andere nabijgelegen nucleïnezuren te splitsen, waarna begeleidende RNA's die zich richten op pathogeen-specifieke nucleïnezuren gedoofde fluorescente probes kunnen splitsen en fluorescentie kunnen vrijgeven.Op basis van deze theorie hebben Kellner et al.[87] ontwikkelde een Cas13-gebaseerde methode [Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKING (SHERLOCK)], en Broughton et al.[88] ontwikkelde een andere benadering op basis van Cas12a [CRISPR Trans Reporter targeting DNA endonuclease (DTECR)].
De afgelopen jaren zijn er verschillende methoden voor de detectie van nucleïnezuren op basis van CRISPR verschenen [89, 90].Conventionele op CRISPR gebaseerde methoden zijn vaak tijdrovend en arbeidsintensief vanwege meerdere procedures, waaronder nucleïnezuurextractie, amplificatie en CRISPR-detectie.Blootstelling van vloeistoffen aan lucht kan de kans op fout-positieve resultaten vergroten.Gezien het bovenstaande zijn op CRISPR gebaseerde systemen dringend aan optimalisatie toe.
Voor CRISPR-Cas12a- en CRISPR-Cas13a-detectietoepassingen [91] is een pneumatisch gestuurd microfluïdisch platform ontwikkeld dat 24 analyses parallel kan uitvoeren.Het systeem is uitgerust met een fluorescentiedetectieapparaat dat nucleïnezuuramplificatie omzeilt en automatisch femtomolaire DNA- en RNA-monsters detecteert.Chen et al.[92] geïntegreerde recombinase-amplificatie met het CRISPR-Cas12a-systeem in centrifugale microfluidica (figuur 5a).Dit werk overwint de moeilijkheid om deze twee processen te integreren, omdat Cas12a boodschapper-DNA kan verteren en het amplificatieproces kan remmen.Bovendien, Chen et al.[92] heeft bovendien de reactiereagentia vooraf opgeslagen in een centrifugale microfluïdische controle om het hele proces automatisch te voltooien.In een ander werk, Silva et al.[93] ontwikkelde een diagnostische methode zonder CRISPR/Cas12a-versterking en een smartphone om SARS-CoV-2 te detecteren (Fig. 5b).Deze test, bekend als een op mobiele telefoons gebaseerd amplificatievrij systeem, bevat een CRISPR/Cas-afhankelijk enzym dat is gebaseerd op smartphonevisualisatie van door katalase gegenereerde belsignalen in microfluïdische kanalen.Gevoelige detectie van minder dan 50 kopieën/µl nucleïnezuur zonder pre-amplificatie, het hele proces van monsterinjectie tot signaaluitlezing duurt slechts 71 minuten.
Nucleïnezuurdetectiemethoden op basis van CRISPR.Centrifugaal POCT voor geïntegreerde moleculaire diagnostiek op basis van CRISPR (overgenomen van [92]).b Ontwikkeling van de CASCADE-test voor smartphone-gebaseerde analyse van SARS-CoV-2 (aangepast van [93]).RAA-recombinase-amplificatie, PAM aangrenzend protospacer-motief, CRISPR-geclusterde korte palindroomherhalingen met regelmatige tussenpozen, CASCADE-systeem zonder mobiele telefoonversterking met CRISPR/CAS-afhankelijke enzymen, 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimidehydrochloride EDC
Als laatste stap in de detectie van nucleïnezuur, weerspiegelt signaaldetectie direct diagnostische resultaten en is het een kritische factor in de ontwikkeling van een efficiënte, gevoelige en nauwkeurige POCT.Signalen kunnen worden gelezen met behulp van verschillende methoden, zoals fluorescerende, elektrochemische, colorimetrische en magnetische strategieën.In deze sectie beschrijven we de grondgedachte voor elke benadering en vergelijken we de moleculaire diagnostiek van infectieziekten in microfluïdica.
Op fluorescentie gebaseerde strategieën worden veel gebruikt voor POCT-diagnostiek van infectieziekten vanwege hun opmerkelijke voordelen van uitstekende gevoeligheid, lage kosten, bedieningsgemak en point-of-care-analyse [94, 95].Deze strategieën gebruiken gelabelde fluoroforen zoals fluorescerende kleurstoffen en nanomaterialen om een ​​detecteerbaar signaal te creëren (fluorescentieverbetering of uitdoving).Deze bevinding suggereert dat op fluorescentie gebaseerde strategieën kunnen worden onderverdeeld in directe fluorescerende labeling, signaal-aan en signaal-uit fluorescerende detectie [96].Directe fluorescerende labeldetectie maakt gebruik van speciale fluorescerende labels om specifieke liganden te labelen die een specifieke hoeveelheid fluorescentie genereren wanneer ze selectief aan een doelwit worden gebonden.Voor signaalgebaseerde fluorescentiedetectie is de kwaliteit van het fluorescerende signaal positief gerelateerd aan de grootte van belang.Fluorescentie-intensiteit is verwaarloosbaar in afwezigheid van een doelwit en is detecteerbaar wanneer een voldoende hoeveelheid doelwit aanwezig is.Omgekeerd is de intensiteit van de fluorescentie die wordt gedetecteerd door "signaal-uit"-fluorescentie omgekeerd evenredig met de hoeveelheid doelwit, waarbij aanvankelijk een maximale waarde wordt bereikt en geleidelijk afneemt naarmate het doelwit wordt vergroot.Bijvoorbeeld, met behulp van het CRISPR-Cas13a doelafhankelijke trans-splitsingsmechanisme, Tian et al.[97] ontwikkelde een nieuwe herkenningsstrategie om RNA's te detecteren die reverse transcriptie direct omzeilen (figuur 6a).Na binding aan complementaire doel-RNA's kan het CRISPR-Cas13-RNA-complex worden geactiveerd, waardoor transcollaterale splitsing door niet-specifieke reporter-RNA's wordt geactiveerd.De fluorescent gelabelde reporter [fluorofoor (F)] wordt gedoofd door de quencher (Q) intact en fluoresceert wanneer gesplitst door het geactiveerde complex.
Het voordeel van elektrochemische detectie is een hoge detectiesnelheid, gemakkelijke productie, lage kosten, gemakkelijk mee te nemen en automatische controle.Het is een krachtige analysemethode voor POCT-toepassingen.Gebaseerd op grafeen veldeffecttransistoren Gao et al.[98] ontwikkelde een nanobiosensor voor de multiplexdetectie van Lyme-ziekte-antigenen van Borrelia burgdorferi-bacteriën met een detectielimiet van 2 pg/ml (Fig. 6b).
Colorimetrische assays zijn gebruikt in POCT-toepassingen en profiteren van de voordelen van draagbaarheid, lage kosten, gemakkelijke voorbereiding en visuele aflezing.Colorimetrische detectie kan de oxidatie van peroxidase of peroxidase-achtige nanomaterialen, de aggregatie van nanomaterialen en de toevoeging van indicatorkleurstoffen gebruiken om informatie over de aanwezigheid van doelnucleïnezuren om te zetten in zichtbare kleurveranderingen [99, 100, 101].Met name gouden nanodeeltjes worden veel gebruikt bij de ontwikkeling van colorimetrische strategieën, en vanwege hun vermogen om snelle en significante kleurveranderingen te induceren, is er toenemende belangstelling voor de ontwikkeling van POCT-colorimetrische platforms voor in-situ diagnose van infectieziekten [102].Met een geïntegreerd centrifugaal microfluïdisch apparaat [103] kunnen door voedsel overgedragen pathogenen in besmette melkmonsters automatisch worden gedetecteerd op het niveau van 10 bacteriële cellen en de resultaten kunnen binnen 65 minuten visueel worden afgelezen (Fig. 6c).
Magnetische detectietechnieken kunnen analyten nauwkeurig detecteren met behulp van magnetische materialen, en er is de afgelopen decennia aanzienlijke belangstelling geweest voor POCT-toepassingen.Magnetische detectietechnieken hebben enkele unieke voordelen, zoals goedkope magnetische materialen in plaats van dure optische componenten.Het gebruik van een magnetisch veld verbetert echter de detectie-efficiëntie en verkort de voorbereidingstijd van het monster [104].Bovendien tonen de resultaten van magnetische sondering een hoge specificiteit, gevoeligheid en hoge signaal-ruisverhouding aan vanwege het onbeduidende magnetische achtergrondsignaal van biologische monsters [105].Sharma et al.integreerde een op magnetische tunneljunctie gebaseerde biosensor in een draagbaar microchipplatform.[106] voor multiplexdetectie van pathogenen (Fig. 6d).Biosensoren detecteren gevoelig subnanomolaire nucleïnezuren geïsoleerd uit pathogenen.
Typische signaaldetectiemethode.Het concept van hypergelokaliseerde detectie van Cas13a (aangepast van [97]).b Grafeen nanobiosensor FET in combinatie met Lyme GroES scFv (aangepast van [98]).c Colorimetrische indicaties voor multiplexdetectie van voedselpathogenen in een centrifugale microfluïdische chip: nr. 1 en nr. 3 monsters met doelpathogenen, en nr. 2, nr. 4 en nr. 5 monsters zonder doelpathogenen (overgenomen van [103]) .d Biosensor gebaseerd op een magnetische tunneljunctie, inclusief een platform, een ingebouwde blokkeerversterker, een besturingseenheid en een voeding voor signaalopwekking/-acquisitie (overgenomen van [106]).GFET grafeen FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS Dimethicon, PMMA polymethylmethacrylaat
Ondanks de uitstekende eigenschappen van de bovenstaande detectiemethoden, hebben ze nog steeds nadelen.Deze methoden worden vergeleken (tabel 1), inclusief enkele toepassingen met details (voor- en nadelen).
Met de ontwikkeling van microfluïdische systemen, micro-elektromechanische systemen, nanotechnologie en materiaalkunde, gaat het gebruik van microfluïdische chips voor de detectie van infectieziekten voortdurend vooruit [55,96,107,108].Nauwkeurige manipulatie van miniatuurapparatuur en vloeistoffen draagt ​​bij aan diagnostische nauwkeurigheid en kosteneffectiviteit.Daarom zijn er voor verdere ontwikkeling inspanningen geleverd om de chips te optimaliseren en te upgraden, wat resulteert in verschillende microfluïdische chips met verschillende structuren en functies.Hier introduceren we kort verschillende veelvoorkomende soorten microfluïdische platforms en vergelijken we hun kenmerken (voor- en nadelen).Daarnaast zijn de meeste van de onderstaande voorbeelden vooral gericht op de bestrijding van SARS-CoV-2.
LOCC's zijn de meest voorkomende geminiaturiseerde complexe analytische systemen en hun activiteiten zijn sterk geminiaturiseerd, geïntegreerd, geautomatiseerd en geparalleliseerd van monsterinjectie en -voorbereiding, stroomregeling en vloeistofdetectie [109, 110].Vloeistoffen worden gemanipuleerd door middel van zorgvuldig ontworpen geometrie en de interactie van vele fysieke effecten zoals drukgradiënten, capillaire werking, elektrodynamica, magnetische velden en akoestische golven [111].LOCC vertoont uitstekende voordelen bij screening met hoge doorvoer en meervoudige detectie, met hoge analysesnelheid, kleine steekproefomvang, laag stroomverbruik en hoge beheer- en bedrijfsefficiëntie;LOCC-apparaten zijn echter zeer delicaat en produceren, verpakken en interfacen.Multiplexing en hergebruik stuiten echter op enorme problemen [96].In vergelijking met andere platforms heeft LOCC unieke voordelen in termen van maximale toepassingsdiversiteit en de beste technologiecompatibiliteit, maar de nadelen zijn ook duidelijk, namelijk hoge complexiteit en slechte herhaalbaarheid.Afhankelijkheid van externe pompen, die vaak omvangrijk en duur zijn, beperkt hun gebruik in POCT verder.
Tijdens de uitbraak van COVID-19 kreeg LOCC veel aandacht.Tegelijkertijd zijn er verschillende nieuwe chips die verschillende technologieën combineren.Smartphones worden nu bijvoorbeeld veel gebruikt als draagbare analyseapparaten en hebben een groot potentieel voor LOCC-integratie.Zon et al.[21] fabriceerde een microfluïdische chip die het mogelijk maakt om specifieke nucleïnezuursequenties van vijf pathogenen, waaronder SARS-CoV-2, te multiplexen met behulp van LAMP en analyseerde ze met een smartphone binnen 1 uur na het einde van de reactie.Als een ander voorbeeld, Sundah et al.[112] creëerde een moleculaire schakelaar [katalytische amplificatie door moleculaire transitiestatusschakelaar (CATCH)] voor directe en gevoelige detectie van SARS-CoV-2 RNA-doelen met behulp van smartphones. CATCH is compatibel met draagbare LOCC en levert superieure prestaties (ongeveer 8 RNA-kopieën/μl; < 1 uur bij kamertemperatuur) [112]. CATCH is compatibel met draagbare LOCC en levert superieure prestaties (ongeveer 8 RNA-kopieën/μl; < 1 uur bij kamertemperatuur) [112]. CATCH совместим с портативным LOCC и обеспечивает превосходную производительность (примерно 8 копий РНК/; < 1 ч при ее11еройатемпеойаемпеойаемпатной CATCH is compatibel met draagbare LOCC en biedt een uitstekende doorvoer (ongeveer 8 RNA-kopieën/µl; < 1 uur bij kamertemperatuur) [112]. CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时）[112]。 CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时）[112]。 CATCH совместим с портативными LOCC и обладает превосходной производительностью (примерно 8 копий РНК/мкл; < 1 часа приатееоаееостью CATCH is compatibel met draagbare LOCC's en heeft uitstekende prestaties (ongeveer 8 RNA-kopieën/µl; < 1 uur bij kamertemperatuur) [112].Daarnaast gebruiken LOCC-apparaten voor moleculaire diagnostiek ook enkele drijvende krachten zoals vacuüm, rek en elektrische velden.Kang et al.[113] demonstreerde een real-time, ultrasnelle nanoplasma-op-een-chip PCR voor snelle en kwantitatieve diagnose van COVID-19 in het veld met behulp van een vacuüm plasmonische vloeibare PCR-chip.Li et al.[114] ontwikkelde vervolgens een rekgestuurde microfluïdische chip die de diagnose van COVID-19 mogelijk maakte.Het platform gebruikt het RT-LAMP-amplificatiesysteem om te bepalen of een monster kwalitatief positief of negatief is.Vervolgens Ramachandran et al.[115] bereikte geschikte elektrische veldgradiënten met behulp van isotachoforese (ITP), een selectieve ionfocusseringstechniek geïmplementeerd in microfluïdica.Met ITP kan doel-RNA van onbewerkte nasofaryngeale uitstrijkjes automatisch worden gezuiverd.Vervolgens Ramachandran et al.[115] Door deze ITP-zuivering te combineren met ITP-versterkte LAMP- en CRISPR-assays, werd in ongeveer 35 minuten SARS-CoV-2 gedetecteerd in menselijke nasofaryngeale uitstrijkjes en klinische monsters.Daarnaast ontstaan ​​er voortdurend nieuwe ideeën.Jadhav et al.[116] stelde een diagnostisch schema voor op basis van oppervlakteversterkte Raman-spectroscopie in combinatie met een microfluïdisch apparaat dat ofwel verticaal georiënteerde goud/zilvergecoate koolstofnanobuizen of wegwerpbare elektrospun micro/nanobuizen bevat.Membraan-gefunctionaliseerde ingebouwde filtermicrokanalen zijn wegwerpbaar.Het apparaat adsorbeert virussen uit verschillende lichaamsvloeistoffen/exsudaties zoals speeksel, nasopharynx en tranen.De virustiter is dus overvloedig en het virus kan nauwkeurig worden geïdentificeerd aan de hand van de Raman-signatuur.
LOAD is een centrifugaal microfluïdisch platform waarin alle processen worden gecontroleerd door een frequentieprotocol dat een microgestructureerd substraat roteert [110].Het LOAD-apparaat wordt gekenmerkt door het gebruik van centrifugaalkracht als een belangrijke drijvende kracht.Vloeistoffen zijn ook onderhevig aan capillaire, Euler- en Coriolis-krachten.Met behulp van een centrifuge-apparaat worden analyses uitgevoerd in continue vloeistofwerking van een radiale binnenwaartse naar buitenwaartse positie, waardoor er geen extra externe slangen, pompen, actuatoren en actieve kleppen nodig zijn.Kortom, een enkele besturingsmethode vereenvoudigt de bediening.De krachten die op de vloeistof in hetzelfde microfluïdische kanaal op dezelfde afstand van het laadcentrum werken, zijn gelijk, wat het mogelijk maakt om de kanaalstructuur te herhalen.LOAD-apparatuur is dus eenvoudiger en zuiniger om te ontwerpen en te vervaardigen dan conventionele LOCC-apparatuur, terwijl de reacties grotendeels onafhankelijk en parallel verlopen;door de hoge mechanische sterkte van centrifugale apparatuur is het beschikbare spaanmateriaal echter beperkt en zijn kleine volumes moeilijk.naar de auto.Tegelijkertijd zijn de meeste LOAD-apparaten ontworpen voor eenmalig gebruik, wat duur is voor grootschalige detectie [96, 117, 118, 119].
In de afgelopen decennia heeft LOAD, dat wordt beschouwd als een van de meest veelbelovende microfluïdische apparaten, veel aandacht gekregen van onderzoekers en fabrikanten.LOAD heeft dus brede acceptatie gekregen en is gebruikt voor moleculaire diagnostiek van infectieuze pathogenen [120, 121, 122, 123, 124], vooral tijdens de COVID-19-uitbraak.Zo hebben eind 2020 Ji et al.[60] toonde een directe RT-qPCR-test aan voor snelle en geautomatiseerde parallelle detectie van SARS-CoV-2 en influenza A- en B-infecties in keeluitstrijkjes.Vervolgens Xiong et al.[74] presenteerde een LAMP-geïntegreerd discoïde microfluïdisch platform voor snelle, nauwkeurige en gelijktijdige detectie van zeven menselijke respiratoire coronavirussen, waaronder SARS-CoV-2, binnen 40 minuten.Begin 2021 hebben de Oliveira et al.[73] demonstreerde een polystyreen toner centrifugale microfluïdische chip, handmatig bediend met een vingertoprotator, voor moleculaire RT-LAMP-diagnose van COVID-19.Vervolgens hebben Dignan et al.[39] presenteerde een geautomatiseerde draagbare centrifuge-microdevice voor zuivering van SARS-CoV-2-RNA rechtstreeks uit wanguitstrijkjes.Medved et al.[53] stelde een inline SARS-CoV-2-aerosolbemonsteringssysteem voor met een kleine roterende microfluïdische fluorescerende chip met een detectielimiet van 10 kopieën/μL en een minimale cyclusdrempel van 15 minuten.Suárez et al.[75] rapporteerde onlangs de ontwikkeling van een geïntegreerd modulair centrifugaal microfluïdisch platform voor de directe detectie van SARS-CoV-2-RNA in door warmte geïnactiveerde nasofaryngeale uitstrijkjes met behulp van LAMP.Deze voorbeelden demonstreren de grote voordelen en belofte van LOAD in de moleculaire diagnostiek van COVID-19.
In 1945 presenteerden Muller en Clegg [125] voor het eerst microfluïdische kanalen op papier met behulp van filterpapier en paraffine.In 2007 creëerde de Whitesides-groep [126] het eerste functionele papieren platform voor het testen van eiwitten en glucose.Papier is een ideaal substraat geworden voor microfluïdica.Het papier heeft inherente eigenschappen zoals hydrofiliciteit en poreuze structuur, uitstekende biocompatibiliteit, lichtgewicht, flexibiliteit, vouwbaarheid, lage kosten, gebruiksgemak en gemak.Klassieke µPAD's bestaan ​​uit hydrofiele/hydrofobe structuren die op papiersubstraten zijn gebouwd.Afhankelijk van de driedimensionale structuur kunnen μPAD's worden onderverdeeld in tweedimensionale (2D) en driedimensionale (3D) μPAD's.2D PAD's worden geproduceerd door hydrofobe grenzen te vormen om microfluïdische kanalen te vormen, terwijl 3D PAD's meestal worden gemaakt van stapels lagen 2D microfluïdische papier, soms door papiervouwen, sliptechnieken, open kanalen en 3D-printen [96].Waterige of biologische vloeistoffen op de μPAD worden voornamelijk gecontroleerd door capillaire kracht zonder een externe stroombron, wat de pre-opslag van reagentia, het hanteren van monsters en multiplexdetectie vergemakkelijkt.Nauwkeurige stroomregeling en multiplexdetectie worden echter belemmerd door onvoldoende detectiesnelheid, gevoeligheid en herbruikbaarheid [96, 127, 128, 129, 130].
Als een ongebruikelijk microfluïdisch platform is μPAD op grote schaal gepromoot en ontwikkeld voor de moleculaire diagnose van infectieziekten zoals HCV, HIV en SARS-CoV-2 [131, 132].Voor selectieve en gevoelige detectie van HCV, Tengam et al.[133] ontwikkelde een nieuwe biosensor op basis van fluorescerend papier met behulp van een zeer specifieke nucleïnezuursonde op basis van pyrrolidinylpeptide.Nucleïnezuren worden covalent geïmmobiliseerd op gedeeltelijk geoxideerd cellulosepapier door reductieve alkylering tussen aminogroepen en aldehydegroepen, en detectie is gebaseerd op fluorescentie.Deze signalen kunnen worden gelezen door een speciaal gemaakt gadget met een draagbare fluorescerende camera in combinatie met een mobiele telefooncamera.Vervolgens hebben Lu et al.[134] ontwierp een op papier gebaseerde flexibele elektrode op basis van nikkel/gouden nanodeeltjes/koolstof nanobuisjes/polyvinylalcohol organometallische raamwerkcomposieten voor HIV-doelwitdetectie door DNA-hybridisatie met behulp van methyleenblauw als een DNA-redoxindicator.Meer recentelijk hebben Chowdury et al.[135] presenteerde een hypothetisch platformontwerp voor point-of-care µPAD-testen met behulp van onbewerkt speeksel van de patiënt in combinatie met LAMP en draagbare beeldvormingstechnologie voor detectie van COVID-19-analyten.
Laterale stromingstests leiden vloeistoffen door capillaire krachten en controleren vloeistofbeweging door de bevochtigbaarheid en kenmerken van poreuze of microgestructureerde substraten.De laterale flow-apparaten bestaan ​​uit een monster, conjugaat, incubator en detectie en absorberende pads.De nucleïnezuurmoleculen in de LFA herkennen specifieke binders die vooraf op de bindingsplaats zijn opgeslagen en binden als complexen.Terwijl de vloeistof door de incubatie- en detectieplaten gaat, worden de complexen opgevangen door de vangmoleculen die zich op de test- en controlelijnen bevinden, wat resultaten oplevert die direct met het blote oog kunnen worden gelezen.Doorgaans kan LFA in 2-15 minuten worden voltooid, wat sneller is dan traditionele detectie.Door het speciale mechanisme vereist LFA weinig handelingen en geen extra apparatuur, wat het zeer gebruiksvriendelijk maakt.Het is gemakkelijk te vervaardigen en te miniaturiseren, en de kosten van op papier gebaseerde substraten zijn lager.Het wordt echter alleen gebruikt voor kwalitatieve analyse en kwantitatieve detectie is erg moeilijk, en het multiplexvermogen en de doorvoer zijn zeer beperkt, en er kan slechts één voldoende nucleïnezuur per keer worden gedetecteerd [96,110,127].
Hoewel de meeste toepassingen van LFA gericht zijn op immunoassays, is het gebruik van LFA voor moleculaire diagnostiek in microfluïdische chips ook effectief en populair [136].In het geval van hepatitis B-virus, HIV en SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137] stelde een op-conversie nanodeeltjes LFA-platform voor en demonstreerde de veelzijdigheid van dit geminiaturiseerde en draagbare platform door gevoelige en kwantitatieve detectie van meerdere doelen zoals HBV-nucleïnezuur.Bovendien, Fu et al.[138] demonstreerde een nieuwe LFA op basis van oppervlakte-versterkte Raman-spectroscopie voor de kwantitatieve analyse van HIV-1-DNA bij lage concentraties.Voor snelle en gevoelige detectie van SARS-CoV-2, Liu et al.[85] ontwikkelde een microfluïdische geïntegreerde RPA laterale stroomanalyse door RT-RPA en een universeel lateraal stroomdetectiesysteem te combineren in een enkel microfluïdisch systeem.
De toepassing van verschillende microfluïdische platforms varieert afhankelijk van specifieke onderzoeken, waarbij ten volle wordt geprofiteerd van de mogelijkheden en voordelen van de platforms.Met betaalbare afsluiters, pompen en kanalen is LOCC het meest uitgebreide platform voor toepassingsdiversiteit en interoperabiliteit met de meeste ruimte voor ontwikkeling.Daarom hopen en bevelen we aan dat de nieuwste onderzoeken bij LOCC als een eerste poging worden uitgevoerd en dat de omstandigheden worden geoptimaliseerd.Bovendien wordt verwacht dat er efficiëntere en nauwkeurigere methoden worden ontdekt en gebruikt in het systeem.LOAD blinkt uit in nauwkeurige regeling van vloeistoffen van bestaande LOCC-apparaten en demonstreert unieke voordelen in enkele schijven door centrifugale kracht zonder de noodzaak van externe schijven, terwijl parallelle reacties gescheiden en gesynchroniseerd kunnen worden.Zo zal LOAD in de toekomst het belangrijkste microfluïdische platform worden met minder handmatige handelingen en meer volwassen en geautomatiseerde technologieën.Het µPAD-platform combineert de voordelen van LOCC en op papier gebaseerde materialen voor goedkope diagnostiek voor eenmalig gebruik.Daarom moet toekomstige ontwikkeling gericht zijn op handige en gevestigde technologieën.Bovendien is de LFA zeer geschikt voor detectie met het blote oog, wat belooft het monsterverbruik te verminderen en de detectie te versnellen.Een gedetailleerde platformvergelijking wordt getoond in Tabel 2.
Digitale analyses verdelen het monster in vele microreactoren, die elk een discreet aantal doelmoleculen bevatten [139, 140].Digitale testen bieden aanzienlijke voordelen voor het uitvoeren van absolute kwantificering door duizenden parallelle biochemische experimenten gelijktijdig en afzonderlijk uit te voeren in compartimenten op micronschaal in plaats van in een continue fase.In vergelijking met traditionele microfluidica kunnen compartimentreacties het monstervolume verminderen, de reactie-efficiëntie verhogen en gemakkelijk worden geïntegreerd met andere analytische methoden zonder dat kanalen, pompen, kleppen en compacte ontwerpen nodig zijn [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147] .De volgende twee methoden worden gebruikt in digitale tests om een ​​uniforme en nauwkeurige scheiding van oplossingen te bereiken, inclusief reagentia en monsters zoals cellen, nucleïnezuren en andere deeltjes of moleculen: (1) druppelemulsies die gebruikmaken van de instabiliteit van het vloeistofgrensvlak;(2) matrixverdeling wordt uitgevoerd door de geometrische beperkingen van het apparaat.Bij de eerste methode kunnen druppeltjes die reagentia en monsters in microkanalen bevatten worden gecreëerd door passieve methoden zoals meestroom, kruisstroom, stroomfocussering, gefaseerde emulgering, microkanaalemulsificatie en membranen door middel van viskeuze schuifkrachten en emulgering met kanaalverandering.lokalisatie [143, 145, 146, 148, 149] of met behulp van actieve methoden [150, 151], die extra energie introduceren door elektrische, magnetische, thermische en mechanische controle.In de laatste benadering wordt de beste uniformiteit van het vloeistofvolume in microfluïdische kamers gedeeld door ruimtelijke structuren van dezelfde grootte te houden, zoals micropits en oppervlaktearrays [152,153,154].Druppels zijn met name grote stroomsecties die ook kunnen worden gegenereerd en gemanipuleerd op elektrode-arrays op basis van digitale microfluïdica (DMF).Electrowetting van diëlektrica is een van de best bestudeerde DMF-theorieën, aangezien electrowetting van diëlektrica nauwkeurige manipulatie van individuele druppels mogelijk maakt, waarbij de vorm van de vloeistof en asymmetrische elektrische signalen die door verschillende kanten gaan, wordt gecontroleerd [141, 144].De belangrijkste bewerkingen met druppeltjes in DMF omvatten sorteren, splitsen en samenvoegen [151, 155, 156], wat kan worden toegepast in verschillende analysegebieden, vooral bij moleculaire detectie [157, 158, 159].
Digitale nucleïnezuurdetectie is een moleculaire diagnostische technologie van de derde generatie, volgend op conventionele PCR en kwantitatieve real-time PCR (qPCR), parallel met high-throughput sequencing en vloeibare biopsie.In de afgelopen twee decennia hebben digitale nucleïnezuren zich snel ontwikkeld op het gebied van moleculaire diagnostiek van infectieuze pathogenen [160, 161, 162].Absolute kwantificering van digitale nucleïnezuurdetectie begint met het verpakken van monsters en reagentia in afzonderlijke compartimenten om ervoor te zorgen dat elke doelsequentie dezelfde kans heeft om elk afzonderlijk compartiment binnen te gaan.Theoretisch kan aan elke sectie meerdere doelsequenties worden toegewezen, of er is mogelijk geen onafhankelijk microreactiesysteem.Via de verschillende hierboven beschreven detectiemechanismen kunnen compartimenten met microbiële doelsequenties die signalen boven een bepaalde drempel genereren met het blote oog of door een machine worden gevisualiseerd en als positief worden bestempeld, terwijl andere compartimenten die signalen onder de drempel genereren als positief worden gelabeld .negatieve, waardoor het signaal voor elke sectie een boolean is.Dus door het aantal gecreëerde compartimenten en de snelheid van positieve resultaten na de reactie te berekenen, kunnen de originele kopieën van de testmonsters worden vergeleken met behulp van de Poisson-verdelingsformule zonder dat een standaardcurve nodig is, die vereist is voor routinematige kwantitatieve analyses zoals als qPCR.[163] Vergeleken met traditionele moleculaire diagnostische methoden heeft digitale nucleïnezuurdetectie een hogere mate van automatisering, hogere analysesnelheid en gevoeligheid, minder reagentia, minder contaminatie en eenvoudiger ontwerp en fabricage.Om deze redenen is het gebruik van digitale tests, met name op druppels gebaseerde methoden, voor moleculaire diagnostiek, waarbij amplificatie- en signaaluitleestechnieken worden gecombineerd, goed bestudeerd tijdens de kritieke uitbraak van SARS-CoV-2.Bijvoorbeeld, Yin et al.[164] gecombineerde druppel digitale en snelle PCR-methoden om de ORF1ab-, N- en RNase P-genen in SARS-CoV-2 in een microfluïdische chip te detecteren.Het systeem was met name in staat om binnen 115 seconden een positief signaal te identificeren, wat sneller is dan conventionele PCR, wat wijst op de effectiviteit ervan bij detectie op het punt van zorg (Figuur 7a).Dong et al.[165], Sow et al.[157], Chen et al.[166] en Alteri et al.[167] paste ook druppel digitale PCR (ddPCR) toe om SARS-CoV-2 te detecteren in een microfluïdisch systeem met indrukwekkende resultaten.Om de detectiegraad verder te verbeteren, hebben Shen et al.[168] realiseerde op ddPCR gebaseerde chip-beeldvorming in slechts 15 seconden zonder het gebruik van beeldsteektechnieken, waardoor het ddPCR-technologieproces van laboratorium tot toepassing werd versneld.Niet alleen thermische amplificatiemethoden zoals PCR worden toegepast, maar ook isotherme amplificatiemethoden worden gebruikt om de reactieomstandigheden en snelle respons te vereenvoudigen.Lu et al.[71] ontwikkelde SlipChip voor druppelanalyse, in staat om in één stap druppeltjes van verschillende groottes met hoge dichtheden te genereren en SARS-CoV-2-nucleïnezuren te kwantificeren met behulp van digitale LAMP (Figuur 7b).Als een snel evoluerende technologie kan CRISPR ook een belangrijke rol spelen bij digitale nucleïnezuurdetectie door middel van handige colorimetrische beeldvorming zonder dat er extra nucleïnezuurvlekken nodig zijn.Ackerman et al.ontwikkelde een combinatorische matrixreactie voor multiplex evaluatie van nucleïnezuren.[158] detecteerde 169 met de mens geassocieerde virussen, waaronder SARS-CoV-2, in druppeltjes die op CRISPR-Cas13 gebaseerde nucleïnezuurdetectiereagentia bevatten in een microwell-assay (Figuur 7c).Bovendien kunnen isothermische versterking en CRISPR-technologie in hetzelfde systeem worden gebruikt om de voordelen van beide te combineren.Park et al.[169] Een digitale CRISPR/Cas12a-assay is ontwikkeld in een commerciële microfluïdische chip voor de detectie van geëxtraheerd en door hitte gedood SARS-CoV-2 op basis van een eentraps RT-RPA met een kortere en hogere signaal-naar-achtergronddetectie tijd verhouding., breder dynamisch bereik en betere gevoeligheid (Fig. 7d).Enkele beschrijvingen van deze voorbeelden worden gegeven in Tabel 3.
Typisch digitaal platform voor nucleïnezuurdetectie.a De snelle digitale PCR-workflow bestaat uit vier belangrijke stappen: monstervoorbereiding, distributie van het reactiemengsel, amplificatieproces en doelkwantificering (overgenomen van [164]).b Schematische weergave van analyse van SlipChip-druppeltjes voor druppelvorming bij hoge dichtheid (aangepast van [71]).c CARMEN-Cas workflow diagram13 (overgenomen van [158]).d Overzicht van geavanceerde digitale virusdetectie met CRISPR/Cas in één pot (overgenomen van [169]).W/O water-in-olie, polydimethylsiloxaan PDMS, PCR-polymerasekettingreactie, DAQ-gegevensverzameling, PID proportioneel integraal derivaat, CARMEN combinatorische matrixreactie voor multiplex nucleïnezuurevaluatie, SARS-CoV-2, ernstig acuut ademhalingssyndroom, coronavirus 2 , RT Amplificatie van reverse transcriptase recombinase polymerase-RPA, S/B signaal op de achtergrond